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Western blot中为什么要进行封闭这一步骚操作 - 知乎
Western blot中为什么要进行封闭这一步骚操作 - 知乎切换模式写文章登录/注册Western blot中为什么要进行封闭这一步骚操作科研不好找星球上的笔记本,超级科研在做Western blot实验中,会用到固相载体,在这些固相载体表面有很多孔隙(如筛子般孔洞),通过恒流湿转或半干转,凝胶上覆着的蛋白质被转移到膜上,蛋白以机械填补和吸附的方式结合于膜表面。蛋白印记到有很多微米级孔洞的NC膜,但是蛋白并不是连续的,而有很多空隙,抗体也是蛋白,也会被吸附在空的孔,这样就会有很多非特异性的信号。为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景,一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该是具有封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位,也不与抗体或检测试剂有交叉反应的特性。抗原或抗体包被时所用的浓度较低,吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙,封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙,从而排斥在其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭液中的蛋白能够狠牢固的结合在空白位置上,这样抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上,而只会跟特异性蛋白结合。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。Western blot转膜后的封闭液的选择应该根据实验的具体要求和条件来决定,不同的封闭液可能会对实验结果产生不同的影响。除了封闭液的选择,还有一些注意事项会影响Western blot转膜后的封闭效果。首先,封闭液的温度和时间应该根据实验的具体情况来决定。一般来说,低温封闭液可以减少非特异性抗体的形成,但同时也可能会影响特异性抗体的结合。因此,需要根据实验的目的和要求来选择适当的温度和时间。根据实验的目的和条件,可以选择不同的封闭缓冲液。例如,对于蛋白质表达较低的样品,可以选择含有高浓度封闭试剂的缓冲液,以提高非特异性结合的抑制效果;而对于蛋白质表达较高的样品,可以选择含有低浓度封闭试剂的缓冲液,以避免影响特异性条带的表达。其次,封闭液的pH值也会影响非特异性抗体的形成。一些封闭液的pH值可能不适合某些抗原的保护,因此需要根据实验的具体情况来选择适当的pH值。除了封闭试剂的选择,封闭步骤的时间和温度也是影响实验结果的重要因素。一般来说,封闭时间不宜过长,以避免非特异性信号的干扰;同时,温度也要适宜,以促进抗原抗体的有效结合。此外,封闭试剂的浓度和膜的清洗次数等因素也会对实验结果产生影响,需要进行适当的调整和优化。一般是将在膜封闭液中4℃下脱色摇床孵育1-2小时左右,封闭孵育后,在TBST缓冲液中冲洗膜3次(每次5min)。除了提到的脱脂牛奶、BSA、酪蛋白和封闭凝胶溶液,还有一些其他的封闭液也可以用于Western blot转膜后的封闭操作。例如,一些实验室会使用封闭血清,如山羊血清或兔子血清,作为封闭液,它们可以为膜上的抗原提供更好的保护。此外,一些实验室还会使用特定的封闭剂,如抗氧化剂或抑制剂,来减少非特异性抗体的形成。总之,封闭步骤是Western blot实验中不可或缺的重要环节,需要认真遵守实验操作规范,选择合适的封闭试剂和条件,以确保实验结果的准确性和可靠性。封闭液的质量和纯度也是影响封闭效果的重要因素。如果封闭液的质量和纯度不高,可能会影响非特异性抗体的形成,从而影响实验结果的准确性。发布于 2024-01-25 19:05・IP 属地湖北western转膜封闭赞同 3添加评论分享喜欢收藏申请
WB的无敌战神之路——封闭 - 知乎
WB的无敌战神之路——封闭 - 知乎切换模式写文章登录/注册WB的无敌战神之路——封闭PTMBio景杰生物WB做得好,导师捡到宝。对于刚入实验室的热血青铜宝宝,WB可谓处处都是轰炸区,一个不小心,分分钟落地成盒。为了帮助大家快速get变强秘籍,提升吃鸡率,我们在此重磅推出《WB实验全攻略》系列文章,助力各位早日成为实验室MVP,进阶WB无敌战神。在上一期的分享中,我们介绍了如何湿转 (WB的无敌战神之路——转膜),今天将接着介绍封闭,我们开始吧~封闭的目的:蛋白通过非共价作用力吸附于膜表面,但是膜上很多位置并未吸附蛋白,封闭液中的蛋白成分可以与膜表面的空白位置结合,从而避免一抗的非特异性结合,产生非特异条带或者背景杂乱。01|封闭液的选择正确的封闭液可以促使抗原抗体更好的结合。对于封闭液的选择,可以通过抗体说明书确定有无特殊的封闭方法,也可根据实验结果进行相应调整。小编在这里给大家总结了常见的封闭液以及它们的优缺点。Ⅰ 脱脂奶粉脱脂奶粉成分复杂,含有多种蛋白,封闭全面。大部分情况下,脱脂奶粉是首选的封闭液 (浓度2.5-5% w/v),经济实惠,可以达到较好的封闭效果。但因含少量残留的生物素和碱性磷酸酶 (AP),它不适用于生物素标记和AP标记的抗体系统。脱脂牛奶也不适用于磷酸化蛋白的检测分析,因为奶粉中含有的酪蛋白是一种磷酸化蛋白,会导致抗体的非特异性结合,使条带背景变脏。Ⅱ 牛血清白蛋白 (BSA)脱脂奶粉不能用于磷酸化蛋白的封闭,分析磷酸化蛋白理论上要用BSA (浓度2-5 % w/v)。WB结果显示,相较于脱脂奶粉,BSA更适用于磷酸化蛋白的检测。遥想当年,我还不知道磷酸化蛋白封闭需要用BSA,一个磷酸化蛋白我整整跑了一个月,总是背景高,血的教训哪!虽然BSA成分单一,但普通级别的BSA可能含有IgG或其他血清蛋白,这些蛋白会与哺乳动物抗体 (如抗牛、山羊、绵羊、马等二抗) 产生交叉反应,增加非特异性背景信号,因此建议使用不含IgG的BSA产品。相对于脱脂奶粉,BSA不含生物素,对于生物素标记的抗体系统而言,可能BSA是最好的选择。Ⅲ 血清血清如胎牛血清FBS含有大量的蛋白质,可以用于封闭。但与BSA一样,它含有免疫球蛋白和血清蛋白,这些蛋白会和哺乳动物抗体产生交叉反应,增加非特异性背景信号。而且血清价格更加昂贵,需要的浓度更高 (5-10 % w/v),因此在WB实验中血清一般用的较少,它更多地应用于免疫组化和免疫荧光实验中样本的封闭。Ⅳ 明胶明胶是胶原蛋白的产物,从冷水鱼皮肤中提取出来的明胶即使在低温情况下也不会凝固,通常使用浓度为0.1-5 % (w/v)。与BSA和血清不同,它不含任何血清蛋白,因此不会和哺乳动物抗体产生交叉反应,这大大降低了非特异性背景信号。但鱼胶含有内源生物素,因此不适用于生物素标记的抗体系统。Ⅴ 混合封闭液有研究表明[1],混合型液封闭效果 (脱脂奶粉+BSA+FBS+明胶) “秒杀”前四种封闭液。如图1所示,不难看出,混合型封闭液的封闭效果最好,信号最强 (该实验使用的是HRP标记的抗体系统)。图1 不同的封闭液对高分子量蛋白CFTR表达的影响/Nitrocellulose:NC膜;FBS:胎牛血清;Gelatin:明胶;Blotto:脱脂奶粉;Mixture:混合液Ⅵ 酪蛋白相对于AP标记二抗,HRP标记二抗灵敏度更高,酶促反应更快。绝大多数实验室用的都是HRP标记二抗。如果有实验室用的是AP标记二抗,小编建议用1 % w/v的酪蛋白进行封闭。酪蛋白在中性和碱性条件下带有负电,会与带正点的膜相互作用,可以用于AP标记的抗体检测系统,缺点是溶解性相对较差~02|封闭的流程01、转膜结束前30 min,以TBST为缓冲体系 (配方见文末) 配置封闭液,并利用涡旋仪、摇床等仪器使封闭液充分溶解并混匀;02、转膜结束后,在抗体孵育盒中加入适量封闭液,并用镊子夹住条带,将其完全浸泡在封闭液中,置于摇床上室温摇动孵育1-2 h,也可以4 ℃冰箱孵育过夜。03|问题解析WB的结果不理想有很多原因,下面我们就分析一下封闭可能会导致的问题吧~1. 条带上有黑色斑点奶粉未完全溶解。出现黑点最常见的原因是奶粉没有完全溶解,建议利用涡旋仪、摇床等仪器使奶粉充分溶解并混匀,或溶解后离心取上清液使用。图2 条带上有黑色斑点2. 条带背景高封闭时间过短。封闭的目的是使封闭液中的蛋白成分与膜表面的空白间隙结合,从而避免一抗的非特异性结合。封闭时间过短可能会导致一抗与空白间隙非特异性结合,背景变脏,可以增加封闭时间,或提高封闭液浓度。图3 条带背景高3. 条带信号弱过度封闭。条带信号弱,可以适当降低封闭液浓度,或者更换封闭液,封闭时间如果过长也可以考虑降低,但如果原本时间是1 h,不建议再缩短时间。但封闭过度很少见,条带信号弱可能要优先考虑其他条件,比如样品新鲜度、上样量、一抗二抗浓度等。 图4 条带信号弱04|TBST配方发布于 2023-02-16 11:05・IP 属地浙江科学实验赞同 2814 条评论分享喜欢收藏申请
全程剖析Western blot原理,你才能掌控它。 - 知乎
全程剖析Western blot原理,你才能掌控它。 - 知乎首发于Western blot踩雷和制作大全切换模式写文章登录/注册全程剖析Western blot原理,你才能掌控它。聊点学术AI病理+量化病理方案设计上上期,我在自己的公众号推出了Western blot(WB)最全避雷手册,反响不错。同时,有人在公众号后台私信我,说他(她)的朋友最近被WB烦的不行,希望能够再出几期,解答他们在WB中遇到的难题。个人思考后觉得,应该从WB原理开始,一步一步捋下来,所谓知其然而知其所以然。让我们红尘作伴,共同努力,驾驭WB实验。Western blot可大致分为以下7步,分别是蛋白提取、蛋白定量、SDS-PAGE电泳、电转印、封闭、抗原-抗体免疫反应、蛋白检测。为此,我将从头到尾剖析WB原理,希望为大家答疑一二。WB是一种把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持物(NC膜或PVDF膜),并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测。WB采用抗体作为探针,抗体可以与附着在固相支持物的靶蛋白的抗原表位发生抗原-抗体免疫反应。这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物(即总蛋白混合物)中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析,旨在鉴别特异性蛋白的类型(如亚型、聚体、剪切体等)和蛋白表达量的变化。一、蛋白提取常规的样品无外乎3种,分别是培养的细胞、动物组织(磨碎或剪碎至肉眼观察无颗粒)、术中切割的肿瘤细胞。这些样品需要在裂解液或强去污剂中充分裂解,细胞中的物质(总蛋白、基因、其它内容物等)才能释放出来,随后离心取上清液(即总蛋白混合物)。常用的裂解成分大多包含Triton X-100、NP-40、十二烷基硫酸钠等,这些成分具有较强的表面活性作用和还原作用,可将细胞膜或核膜裂解,释放其中的物质。同时,裂解液中还包含其它成分,如Tris-Hcl作为缓冲剂,可防止蛋白在提取过程中变性;以及Nacl,可防止提取的蛋白由于非特异性的聚集而形成聚体等。不同公司生产的裂解液成分大同小异,多是以上成分按不同比例组成,可分为弱、中、强三种不同裂解能力的裂解液。最重要的是我们要清楚自己研究的蛋白到底在细胞哪里表达,是细胞膜、胞浆还是细胞核。这决定我们该使用哪种强度的裂解液。如果裂解不充分,我们抽提的总蛋白中可能已经不包括目标蛋白或目标蛋白随着沉淀物被丢弃,那么整个WB实验从一开始就悄无声息地失败了。二、蛋白定量为什么要蛋白定量?首先要知道WB的目的是什么。WB是要比较同样细胞数量的细胞或同等重量的动物组织中目的蛋白的表达量高低变化。那么首先,我们需要控制样品本身重量大小或细胞数量的多少对实验结果的影响,故不同组间的样本需要控制一致才能提取蛋白。因此,在第一步中提取的蛋白上清液即是同等质量下,同样提取方法下,抽提的总蛋白混合物,这里面包含了各种各样的蛋白。我们必须知道这个上清液中的总蛋白浓度,才能在第三步电泳时保证每一个上样孔中加入的总蛋白质量一致,这样后面对条带上的蛋白定量分析才是有意义的。我们怎样才能知道这个上清液中,总蛋白的浓度呢?目前有4种方法,分别是双缩脲法、Lowry法、Bardford法和BCA法。较常用的是BCA法,其原理:蛋白质可在碱性环境下将2价铜离子还原为1价铜离子,而1价铜离子可以与BCA试剂发生颜色反应,2分子的BCA螯合后可形成紫色的复合物,这种复合物具有非常好的吸光性(用OD值反应)。在562nm的紫外光下,溶液中复合物的OD值与蛋白浓度在一定范围内呈现良好的线性关系。我们可以通过这种线性关系大致地计算出自己的样品中总蛋白浓度。自然而然,我们需要一个OD值-蛋白浓度标准曲线。购买商用的蛋白标准品(即包含已知浓度的蛋白溶液),一般有25μg/μl、5μg/μl、4μg/μl三种。首先,按照(铜离子体积:BCA regent体积=1:50)配制BCA工作液。准备好4mg/ml蛋白标准品,使用去离子水倍比稀释蛋白标准品,最后配成2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0等共8个不同浓度的蛋白溶液,单位μg/μl。随后将自己的要测的样品按照一定倍数稀释(因为待测样品的蛋白浓度肯定是过高而超过BCA检测的线性范围,稀释倍数根据样本类型和经验来定)。采用96孔板,每孔中加入200μl的BCA工作液和20μl待测样品(一个孔一个样品,如待测样品数量为15,则一共使用标准蛋白梯度浓度的8个孔+15=23个孔,个人建议每个孔做2个复孔,防止加样误差)。随后放入37℃孵育箱,孵育30min,促使发生紫色螯合反应。孵育结束后立刻拿到酶标仪中,在562nm光下,测算每一个孔的OD值,并通过标准蛋白梯度浓度和其相应的OD值用EXCEL表得出OD值-蛋白浓度线性公式(R方值建议0.99以或以上);同时根据待测样品的OD值和上述公式计算出每一份样品中总蛋白的浓度。定量好的蛋白根据体积比例加入5X或者1X的蛋白上样缓冲液,96℃以上水浴10min,使蛋白充分变性,解除二级或三级结构,只保留一级链式结构。上样缓冲液一般成分及作用:SDS,可使得蛋白裹上足量的负电荷,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异;DTT还原剂,可打开巯基维持单链的线性结构;甘油,可起沉降作用使得混合的样本沉降到加样孔底部,不会逸散至加样孔以外;溴酚蓝为小分子蓝色物质,有指示作用。三、SDS-PAGE电泳终于到了电泳时刻。电泳是为了使得我们的加样孔中同等质量的总蛋白在相同电场作用下,从配置好的凝胶中由上往下迁移。我们都学过物理,知道带电物体在电场中移动距离与物体本身的电荷、物体的质量相关。蛋白质本身的电荷、质量、结构是不同的,这些都是影响蛋白在凝胶中移动的因素。通过煮沸,我们消除让蛋白仅保留了一级结构;上一步添加的上样缓冲液中SDS消除蛋白质本身电荷的差异。那么此时,上样的总蛋白中各种各样蛋白在凝胶中的迁移距离只与蛋白的质量相关。电泳时,整个凝胶处在一个大致呈“U”型的电场中,因此市场能看到电场强度过高时,整条溴酚蓝呈现微笑的形状。借助电泳时的电场力作用,首先总蛋白在较小电压下移动到浓缩胶和分离胶的交界处,此时见溴酚蓝呈现一条笔直的蓝线;随后,在高电压的作用下,所有孔道中的蛋白会同时开始向下迁移,一定时间后,总蛋白中各种蛋白会在分离胶中的不同位置中分离开,分离后蛋白所处的水平位置只与蛋白分子量大小有关。分子量大的蛋白靠上,而分子量小的蛋白靠下,溴酚蓝则在最下面的位置。每一种分子量的蛋白会在分离胶中形成一条直线,当然我们是看不见这条线的,这也是为什么我们要加溴酚蓝的目的,溴酚蓝刚好跑出最下方玻璃板时,电泳就可以停止了,否则你关注的小分子量蛋白可能会跑出胶外。我们可以通过彩色的Marker来大致地确定目标蛋白在哪里。电转印的时间和电转强度需根据蛋白分子量来决定。四、电转印电转印就是将凝胶中的蛋白,转移到固相支持物上,即常用的NC膜和PVDF膜。这两种膜表面都有肉眼不可见的小孔,都可以用来电转印。NC膜全称硝酸纤维素膜,带负电荷的蛋白质可以与膜发生疏水作用而结合到一起,价格便宜,韧性差易碎,但易于封闭非特异性结合;PVDF膜全称聚偏二氟乙烯膜,使用前需用无水甲醇活化(膜表面的正电基团可被无水甲醇活化),易于吸附蛋白质,价格贵,韧性强,适合小分子量蛋白电转印。电转时,电场是垂直于我们的凝胶和膜的。因此凝胶中的蛋白质再次在电场作用下向紧贴着凝胶的膜上转移,并最终被吸附在膜的表面。我们可以通过丽春红染色大致地评价电转印的情况(丽春红可将膜上调的蛋白染成红色,而膜其它位置基本不着色),但是丽春红染色仅仅是粗糙的评价方法,并不是我们的目标蛋白是否转移到膜上的直接证据,做>150KD分子量蛋白的同志们尤其得注意。电转印的时间和电转强度需根据蛋白分子量来决定。五、封闭一旦电转印结束,我们就开始了封闭的过程,常采用5%、8%的脱脂奶粉或胎牛血清,室温下,摇床孵育膜1h。常规采用奶粉即可,但是做磷酸化蛋白或某些特殊蛋白时必须使用胎牛血清封闭,因为奶粉中含有大量酪氨酸,可使磷酸化蛋白的条带变浅,甚至消失,同时也可能出现较高背景。为什么要封闭呢?我们知道,电转后蛋白质已迁移至膜的表面,此时膜上还存在大量的、未吸附蛋白质的小孔。此时我们采用牛奶或胎牛血清封闭,其中包含大量的蛋白质,这些蛋白质会吸附在那些小孔上,堵住这些孔。如果没有封闭,那么在下一步我们添加的一抗将同时吸附在目标蛋白和膜表面其它位置,且很难洗掉,最终ECL发光检测时可出现非特异性条带、杂带、高背景等等,浪费抗体不说,还会影响最终的判断。当然,这些奶粉中的蛋白也会一定程度地吸附到目标蛋白表面,但是抗原-抗体特异性反应相比,这种非特异性的结合会很轻松的在后面漂洗步骤中消除。有时候也会遇到未封闭,但没有出现杂带。对此,我只想说,常在河边走,哪有不湿鞋啊。六、抗原-抗体免疫反应这一步是比较简单的。就是你购买的特异性抗体与你的目标蛋白发生抗原-抗体特异性免疫反应。首先是一抗与目的蛋白表面的抗原表位结合,而膜表面其它位置的孔因为被封闭过程中牛奶的蛋白质说填满,因此结合量很少,后面漂洗时可去除。比较重要的是一抗孵育温度和时间,最常用的条件是4℃摇床过夜孵育,温度适宜,分子运动温和。有人也用37℃孵育1-2h,可能会成功,但是温度越高,分子间的运动越激烈,那么出现非特异性杂带的可能性就越高;同时孵育时间较短,也可能会导致一抗与目标蛋白结合不充分。当然,如果你使用的是多克隆抗体,那情况就更难说了,参考上上期避雷手册。一抗结合之后,就是采用的二抗,二抗可与一抗结合,而二抗蛋白结构被HRP辣根过氧化物酶标记,可与发光底物相结合,该底物极强的信号输出能够使皮克量的蛋白得到检测。总之,选好自己的一抗是很重要的。特异性高的一抗,WB你怎么做都能出;特异性差的抗体,WB发明人都不一定做得出来。建议不要省钱买国产抗体,你懂得。买抗体之前,看看近年发的高分文章,查查他们用的什么哪个公司抗体。如果找不到参考,一定要买经过该抗体公司敲除验证过的抗体。七、蛋白检测前几步,我们几乎无法看到膜上有啥变化,条带也看不见在哪,反正就是一直将膜洗洗涮涮。终于到了蛋白检测,这也是WB最后一步,终于可以一睹蛋白条带的真容了。蛋白检测包括DAB法和ECL发光法。DAB法就是和免疫组化染色类似,出现的条带在肉眼下即可见,呈现棕黄色,条带可保存1-2年,但是现在用的较少。目前较多采用的是ECL化学发光法,ECL工作液包括鲁米诺(是的,就是我们在刑侦节目案发现场看血迹的东西)和过氧化物,二者避光保存,现配现用(1:1配制),用时滴在膜上就行,目标条带将在黑暗环境下发出荧光,荧光会进一步胶片上曝光,荧光越强则胶片上曝光的条带越黑,最后洗出胶片即可。现在还有凝胶成像仪可以使用,省去了胶片曝光和洗胶片的步骤,方便而高效,再也不用去小黑屋待着发光了。至于胶片上的黑色条带该怎么分析,这又是另外一个话题了,今后会和大家再聊一聊。终于敲完了,已秃......欲知更多科研技能,请搜索微信公众号“聊点学术”。发布于 2020-03-18 15:17分子生物学实验医学科研赞同 126663 条评论分享喜欢收藏申请转载文章被以下专栏收录Western blot踩雷和制作大全临床医生
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western blot是为了什么? - 知乎首页知乎知学堂发现等你来答切换模式登录/注册实验western blot是为了什么?本人大一,刚进实验室,师兄简单讲了遍原理步骤就开始让我每周跑一次,我每次都是很机械的操作,想知道最后的图像能看出什么来?为什么要做wb?关注者143被浏览181,170关注问题写回答邀请回答好问题 15添加评论分享15 个回答默认排序科研根号三江苏赛尔普生物,流式实验、单细胞测序、蛋白芯片、免疫检测等 关注这篇内容的收藏越来越多了,发现大家都喜欢收藏但是不喜欢点赞,各位老铁们收藏的时候记得双击给我点个赞同啊~题主能提出这个问题,证明你真的很适合做科研,因为你不只是机械性做事,你还会思考。但是你可以胆子再大一点,除了做实验,你还可以找师兄师姐多交流,同时自己多学习,这样在交流的时候不至于有太多的知识盲区。关于western blot实验的原理(为什么要做这个实验),实验结果怎么看。以及做不出想要的结果该怎么办,这些问题你可以看下我今天的分享。另外如果你想系统的学习western blot实验,你可以学习下我分享这些关于Western blot实验技术的学习资料,链接分享给你。Western blot学习资料汇总 链接:https://pan.baidu.com/s/1NfzHs1ZxvGdWIxIzu8iuEg?pwd=hv6x 提取码:hv6x 额外分享:有需要的小伙伴可以自行下载~免费,亲测安装!56个科研人必装软件安装包 (11月更新)实验数据/图片处理+文献管理+科研绘图+写作翻译+统计分析+办公常用链接:https://pan.baidu.com/s/1JkjM67dHoKsY3K5AkLGrTg?pwd=6868 提取码:6868 western blot作为免疫学三大实验之一,是所有生物医药科研人必须要掌握的实验之一。WB,是Western blotting的缩写,即蛋白质印迹法,又称免疫印迹(immunoblotting),也就通过电泳技术分离不同组分,再采用印迹技术将蛋白质转移(“印”)到特定的膜上,再利用抗原-抗体的特异性结合原理,用抗体作为探针去实现检测复杂样品中的靶标蛋白的方法,这项技术也可以用来检测不同时期蛋白表达的水平以及蛋白相互作用等方面。WB由来1975年,英国人Edwin Mellor Southern发明了基因组DNA特定序列定位的方法:将待测定DNA分子从琼脂糖凝胶中转移到一定的固相支持物硝酸纤维素膜(NC膜)上,即印迹(blotting),然后膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下杂交,检测特定DNA片段,并将这种方法命名为Southern印迹法;后来Alwine又用类似方法检测RNA,正好与DNA相对应,故被称为Northern印迹杂交;1981年Burette成功将对单向电泳分离后的蛋白质分子转印到膜上并进行免疫学分析(如抗体抗原特异性结合),这种印迹分析称为Western印迹法;而Eastern blotting是Western blotting的变形,只是检测对象变成了双向电泳后的蛋白质分子(所谓的双向电泳是等电聚焦-聚丙烯酰胺凝胶电泳(IEF-PAGE)分离蛋白质)。实验原理WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)将混合蛋白质样品分离后,利用特殊虹吸或电场装置印迹至与相对应的第一抗体特异性结合,之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合,最终通过底物显色或放射自显影来检测特异性目的基因表达的蛋白成分。Western Blotting先使用PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)电泳分离出待检测的蛋白质,再用电场装置印迹至固相介质(如PVDF膜)上,固相介质以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及生物学活性不变。再以膜上的蛋白质片段作为抗原,与一抗(“探针”)特异性结合起免疫反应,再与酶或同位素标记标记的二抗结合,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。实验流程SDS-PAGE凝胶电泳:(1)分离胶①配制:根据蛋白分子量大小确定合适的凝胶浓度后,可参考凝胶配置试剂盒中的说明书(如目标GFP蛋白为25kDa,采用8%-16%梯度浓度的胶),或自行参考文献配置。依次加入所需试剂于配胶专用烧杯中,轻轻并缓慢吹打胶溶液以混匀,用移液枪吸取液体和打出液体速度应至少保持在2-3s左右。注意:放液时不能全部放出,否则容易产生气泡,影响实验结果(有气泡的地方不导电);配胶的APS需要在4℃的冰箱中保存;胶在加APS与TEMED促凝剂前一定要混匀其他组分。电泳凝胶制备参考浓度②灌胶:配10%分离胶,加入TEMED后立即摇匀就可开始灌胶。灌胶时,可用移液枪吸取胶沿玻璃板壁缓缓放出注入胶室,待胶面升到绿带中间线高度时即可。再次强调注意控制速度,避免气泡。然后加入适当剂量的纯水或无水乙醇以封胶,以盖住分离胶为准。③凝胶:在室温下开始凝胶30min。注意:凝胶过程中胶板应当保持稳定,不可晃动,否则导致分离胶液面不平。④倒压胶液:当压胶液和分离胶之间有一条折射线时,说明胶已大致凝固。再等大约3min,胶就充分凝固。此时将压胶液倒入废液缸,并用吸水纸伸入两板间的胶室将残留的压胶液吸干,但要注意别碰到分离胶表面。(2)浓缩胶①配制:与分离胶操作一致,只是所需试剂不同。②灌胶:配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀灌胶。灌胶操作参考分离胶灌胶。③插样品梳:灌胶后立即将样品梳缓慢插入凝胶中,样品梳插入后应与胶板保持平行,不应倾斜。④凝胶:大约20min浓缩胶凝固,双手用食指与拇指捏住梳子,缓慢轻轻竖直向上拔出梳子,切记不要拔歪,保证齿口整齐。(3)电泳将胶板放入电泳槽中,并加入1×Tris-甘氨酸或SDS电泳缓冲液,入足量的样品和合适的蛋白marker。电泳槽连接电泳仪。上槽接负极,下槽接正极,通电起始电压80V,10min后100V,电泳2h或当溴酚蓝迁移至离底部1cm时,停止电泳。注意不能让溴酚蓝跑出去。转膜转膜指的是把蛋白从凝胶转移至特定材质的膜上,我们本次采用PVDF膜,不同膜的性质不同,具体详情参考表2。依据胶的大小裁剪膜和滤纸6张,置于缓冲液中平衡10min。PVDF膜则需用纯甲醇浸泡湿润1-2s。采用“湿转移”,即把“三明治”黑板-海绵-3层滤纸-胶-膜(正面朝下,分清左右,与胶对应)-3层滤纸-海绵-白板依次放好,并完全浸入缓冲液中湿透操作(注意:黑色板的一面对黑色负极,湿转过程中不能干,轻轻用刮板赶走气泡)。湿转完成后,夹紧板放入湿转电转槽内,在转膜槽中加满电转液,插上电极(100V,1h),开始转膜。转膜槽置于有冰袋的泡沫箱中,保证电转一直处于低温下进行。转膜结束后,切断电源,取出杂交膜。封闭与孵育转膜之后迅速置于Tris-Buffered Saline(TBS)中,于回旋振荡器上室温下漂洗5min,以便移除残留的转移缓冲液。随后将膜用TBST从上向下浸湿后,转移至含有封闭液(TBST做溶剂,配5%脱脂牛奶)的平皿中,室温下脱色摇床上摇动封闭2h或4℃过夜封闭(PVDF膜在甲醇活化后是带电的,因而在转膜时会将蛋白吸附,所以封闭的目的就是要将PVDF膜上无蛋白的部分空隙用奶粉填满,以免孵抗体的时候一抗二抗与之结合,产生非特异条带或者是背景杂乱)。一抗:加入合适稀释浓度的一抗(用TBST稀释),室温,脱色摇床孵育1h;TBST室温脱色摇床洗3次,每次10min(一抗只能结合能与其特异结合的蛋白,其他没有结合的就被洗下来了)二抗:加入合适稀释度(用TBST稀释)的碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗,室温,脱色摇床孵育1h;TBST室温脱色摇床洗4次,每次5min(二抗只能结合能与已结合蛋白的一抗结合,其他没有结合的就被洗下来了)显色辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法:用微量移液器取等体积的ECL试剂中的A、B发光液放在EP管中恢复至室温,按比例稀释混合。用去离子水稍微漂洗PVDF膜,再用滤纸贴脚吸去膜上残余液体,将膜平放,反贴法覆于A、B混合液滴上,避光反应3分钟,可适当延长;舍弃ECL混合液置于暗盒中曝光显影,曝光时间控制在30s左右。取出胶片立即完全浸入显影液中 1~2min,清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影,清水冲净晾干,标定Marker,进行分析与扫描。WB灰度分析关于WB结果的灰度分析,可以看下面这篇WB异常结果盘点与原因解析12个高频异常结果#1 无背景无条带经验分享上图展示一点信号都没有,大部分情况是因为抗体加错了。如果中间出现细微的条带,可能是蛋白上样量太少,一抗浓度过低,ECL 发光液失效。#2 高背景经验分享高背景是 WB 实验中最常见的问题,目的条带单一清晰,但其他地方又弥漫性较均一的背景(比较连续的)。杂带多大概率是抗体特异性不好,也有可能抗体浓度太高,可尝试降低一抗浓度进行实验。#3 非特异性条带经验分享此种情况绝大多数是因为一抗不好,你无法判断哪一条是目的条带。如果实在没有更好的抗体,建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。当然也有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。#4 条带中出现边缘规则的白圈经验分享我们常常将电转液倒入一个盘子里,倒入的液体不宜太多或太少,建议高度与放上第一层滤纸齐平,然后往滤纸上浇点转膜液,往胶上面浇点电转液,用两只手的拇指和食指轻轻夹住 NC 膜的两侧中间,使膜成 U 型,然后将 U 型底部接触胶的中间,慢慢往两边放下膜,这样一般气泡很少。然后上层滤纸同样用 U 型的放置方法,用玻璃棒稍微贴实下,最后盖上海绵。#5 出现黑点和黑斑经验分享牛奶溶解后,最好静止一下,然后轻轻吸取上层牛奶进行封闭,封闭结束后一定要洗 3 遍之后再加一抗。#6 条带拖尾经验分享这种情况一般出现在大分子量抗体实验中,是因为一抗浓度太高,作用时间太长引起的。另外洗一抗和洗二抗千万不要偷工减漏,建议 5min*5 次,不要担心洗这么多次把抗体和蛋白洗掉了,真正的抗原抗体相结合通过这种方式是洗不掉的。#7 出现非均一性背景经验分享封闭时洗一抗洗二抗,以及发光时都应时刻注意切记蛋白面风干,一旦风干很可能会导致这个结果。#8 某个条带变形经验分享很多实验室中使用的不是最新设备,比如配胶用的海绵垫,如果用了很多年,会从下面往上面漏小气泡,当气泡足够小并且胶快凝固的时候,走到中间的小气泡就停留在胶内,并会影响到后面的跑胶。另外配胶用的水,SDS,Tris 缓冲液要注意不要有杂质。#9 条带不均一经验分享出现哑铃最大的可能是胶没有配好,胶凝固后不均一。如果你拔完梳子后出现上图中下面部分的情况,多半会出现哑铃状。另外还有一种可能是样品中含有太多杂质,没有离心下来,然后杂质沉积在孔的中间,蛋白自然被推挤到两边。#10 最边缘条带弯曲经验分享一般我们使用的是 10 孔的胶,如果你上样刚好 10 个孔,那么最两头的两个孔肯定会歪曲。另外上样最好在胶的中间,这样电场均一#11 条带笑脸,marker正常经验分享准备样本主要确认上样缓冲液是否为近期配置,并且要妥善保存,否则就会浪费珍贵的实验样本。一般电泳过程中恒压电泳,浓缩胶 80V,分离胶 120V,整个过程差不多需 2 个小时左右。#12 曝光结果条带扭曲经验分享对于大分子量的抗体,跑胶前可以先把样本煮一下,然后稍微离心一下,同样也可以改善这种情况。7个灵魂提问#1 为啥条带形状不好看?可能的原因有:a.胶凝的不均匀或聚合不好,建议灌胶前将溶液充分混匀b.某些样品盐浓度较高,建议除盐或将样品盐浓度调成一致c.缓冲液陈旧,成分改变,可以重配d.凝胶下面有气泡,电泳前要先将气泡赶走e.电泳时温度过高,可以降低电流或电压f.样品中含有不溶性颗粒,建议样品充分搅拌混匀#2 蛋白条带位置(大小)不对咋整?可能的原因有:a.胶浓度不对,不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差,可以调整浓度b.抗体孵育不充分,建议增加抗体浓度,延长孵育时间c.酶失活,建议直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物d.目的蛋白存在翻译后修饰或剪切体,建议查询相关文献确定e.标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低,建议设置阳性对照比对结果,增加标本上样量#3 暗背景上白色带是咋回事?可能的原因有:a.抗体与封闭试剂反应,建议使用前过滤封闭试剂b.HRP含量过高,建议降低酶联二抗的浓度c.HRP偶联二抗中有聚集体,建议过滤二抗试剂,去除聚集体d.抗体分布不均匀,建议孵育抗体时使用摇床#4 细胞提取液中没有检测到目的蛋白?可能的原因有:a.细胞中不表达这种蛋白质,换一种细胞;b.抗体不能识别目标蛋白,多看看说明,是否有问题;c.可能是没有保持低温操作,样品保存不当,样品放置时间过长;d.细胞中的蛋白质被酶降解掉了,可加入蛋白酶抑制剂,抑制蛋白酶活性。#5 目的带很弱,如何加强?a.可以加大抗原上样量,这是最主要的;b..也可以将一抗稀释比例降低;c.还可以延长曝光时间。#6 我做的蛋白质分子量很小(10KD),怎么做WB?a.可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜,转膜时间缩短,另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系;b.也可以选择PSQ 膜,同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起,再转移。其他按步骤即可。#7 有很多杂带咋回事?可能的原因有:a.目的蛋白有多个修饰位点,本身可以呈现多条带,建议查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白实际大小b.样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂;样本处理时在冰上操作c.杂蛋白多,建议处理目的蛋白d.抗体特异性不强,建议使用特异性强的抗体e.抗体孵育时间过久,建议减少抗体孵育时间f.二抗与抗原有交叉反应,建议选择合适的封闭物g.二聚体或多聚体存在,建议增加蛋白质变性过程及强度h.底物显色与曝光时间过长,建议缩短显色及曝光的时间电泳和转印环节的 11 条 TipsTip 1:洗净上样孔在加样之前,用移液枪吹洗每个上样孔,洗净残留在上样孔中的丙烯酰胺残渣,从而避免畸形条带的出现。Tip 2:凝胶过热是大忌如果凝胶在电泳过程中温度过高,则条带可能会出现「微笑」形状,即条带两侧向上弯曲的现象。切记要正确使用缓冲液,并控制好电泳功率,避免凝胶过热的出现。Tip 3:确保样品缓冲液离子强度正确样品中的盐离子强度过高(或过低),都会导致条带出现偏斜或扭曲。如果样品提取过程中用到高盐溶液,就有可能要在上样前进行稀释或脱盐处理。Tip 4:不要过载上样加大上样量有利于检测稀有目标蛋白。但过大的上样量会导致电泳过程中出现垂直条纹。如果必须大量上样时(> 30 ug 总蛋白),可将电泳电压降低 25%,有助于减少条纹。Tip 5:转印三明治要去除气泡均匀的蛋白质转印需要三明治的各组件之间完全接触,尤其是凝胶和膜完全接触。没有去除的气泡会导致膜上出现空白点,直接影响实验结果!建议使用凝胶滚轮将这些气泡通通赶走!(提示:梯度凝胶最好上下滚动,而不是左右滚动。左右滚动会导致梯度凝胶翘曲和起皱。)Tip 6:转印前的预平衡湿转和传统半干转时,将凝胶电泳缓冲液替换为转印缓冲液可获得更好的转印效果。电泳缓冲液的带入会增加电导率,从而导致转印过程中产生过多的热量。可在水中短暂冲洗凝胶,然后在转印缓冲液中平衡凝胶 15 分钟,平衡膜 5 分钟。请注意,对于某些快速转印系统,不建议使用凝胶预平衡,请遵循制造商的操作指南。Tip 7:NC 膜转印时避免使用 SDS转印缓冲液中的 SDS 会降低蛋白质与硝酸纤维素膜的结合效率,所以在使用 NC 膜时要避免缓冲液体系内有 SDS。转印前用水冲洗凝胶,以便减少 SDS 带入转印体系。Tip 8:PVDF 膜可使用 SDSSDS 可以促进蛋白质从凝胶中洗脱,如果某些蛋白质难以从凝胶中洗脱,则可以将 SDS 添加到转印缓冲液中,前提是必须使用 PVDF 膜。Tip 9:避免膜变干在转印之前和之后均需保证膜的湿润,从转印三明治中取出后,转印热量会使膜容易变干燥。应迅速将膜浸入预先准备好的缓冲液中,以免膜干燥。(尤其是在使用 PVDF 膜时要格外注意,因为 PVDF 膜是疏水的更容易变干)。如果干了,可将硝酸纤维素膜重新在缓冲液中浸湿,而 PVDF 膜则需要在醇中重新活化。Tip 10:半干转印功率及时间设置使用高电场转印可获得更高的转印效率,但是一定要注意系统的散热能力,避免凝胶过热。转印期间,「三明治」温度升高会导致电阻变化,进而引发转印效率不均一,缓冲液失去缓冲能力,甚至凝胶融化。半干转印在电流下降接近为零时,延长转印时间不会增加转印效果。Tip 11:使用两张膜判断蛋白是否会转穿薄胶或低浓度胶转印过程中蛋白容易转穿,特别是针对小分子量蛋白。可以转印时叠放两张转印膜,然后对第二张膜进行总蛋白染色(丽春红或 Stain-Free 免染)的方法来判断是否已经转穿。提高跑胶质量的7条TipsTip 1:蛋白分子量偏高或偏低可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应,比如说 100KD 的蛋白你用 12% 的胶跑,或者说 20KD 的蛋白你用 8% 的胶跑。Tip2:蛋白质降解蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带,然后出现一些其他带,最主要的特点是所有的条带比正常的都低,并且条带模糊不清晰。Tip3:所有条带连成一片无间隔最可能是上样量过多,其次是样品弥散(比如电泳长时间停止样品弥散)。Tip4:溴酚蓝拖尾样品溶解不好或上样前未变性完全。Tip5:纵向的纹理上样样品中存在不溶性颗粒。Tip5:溴酚蓝很粗浓缩胶浓缩效果不好,可能是浓缩胶太短或者配错。Tip7:在分离胶中跑不动Tris-Cl pH 值不对,或者忘记加 SDS。推荐内容绝密!2023年国自然立项清单表可下载(生命科学部+医学科学部),附往年1000+份中标标书!如何查看国家自然科学基金的的摘要和下载结题报告? 有哪些好用的zotero插件?有什么适合药学/生物方向科研小白的简单易学的科研绘图工具?有没有什么很好的科研作图软件?顶级图像分析软件,Image J、Fiji、Image pro plus,一次帮你搞定! NoteExpress和EndNote相比哪一个更好用?(附安装包)2023年更新!EndNote X9永久激活版本(序列号激活),最稳定,可汉化!写的太全了,Endnote 插入文献以及调整参考文献格式,这是知乎上最好的教程!太牛了!Zlibrary回归,这里有最稳定的访问指南!western blot是为了什么?如何学习和记忆细胞信号通路?最值得推荐装!GraphPad Prism 9.3 ,功能更多!SPSS 27 安装激活,授权日期到期时间2037年 收藏越来越多啦,感谢大家对内容的认同,也麻烦各位老铁们双击点个赞同,非常感谢~❥(^_-)编辑于 2023-12-11 16:31赞同 44516 条评论分享收藏喜欢收起酸菜科研等 2 个话题下的优秀答主 关注Western blot(蛋白印迹)作为科研研究中最为平常的实验,却蕴含了很多知识,可谓是小实验里却有大文章。尽管绝大多数研究僧在接触该实验时都会被虐的体无完肤,却也在和WB斗志斗勇的过程中积累了不少经验。正所谓前人种树,后人乘凉,现在我就把各位前辈做WB的各种经验总结起来,全文如下↓同时,也为大家整理了一份实验 Protocol 资源包。标书、毕业论文都能用上!包括不同研究水平实验技术Protocol,常见细胞动物实验技术总结,不同实验方法全流程,WB实验流程、注意事项、数据处理及写作,IHC实验流程、操作技巧、注意事项、图像分析等,全都是经过前辈们无数次验证过的,绝对靠谱!搭配5节PCR免费课程,希望你科研不愁。点击免费领取正文开始。WB实验的基本常识WB的基本原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移至一种固相支持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测,经常用于目的蛋白的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋白的互作。依其原理,可分为两种方法:A、直接法和B、间接法。两种的方法的优缺点比较:WB的一般流程:蛋白的提取需谨记:好的蛋白是WB成功的一半!经验总结:1.合适的盐浓度下,保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。2.尽量除去核酸、多糖、脂类等干扰分子3.提取蛋白质过程中,应在低温环境下进行,以抑制蛋白酶的水解作用(可加入适合的蛋白酶抑制剂)。4.蛋白样品建议分装后冷冻干燥或直接以液体态置-80℃中保存,不要反复冻融。5.蛋白浓度低时,可使用超滤膜浓缩或者用真空冻干机将蛋白冻干。电泳凝胶浓度与蛋白分离范围经验总结:1.上样时:根据蛋白表达丰度调整蛋白上样量,尽量保证每孔上样量保持一致。2.胶最好现配现用,如果需要保存,最好用湿润的保鲜膜包好并置于4℃冰箱中。3.为了检测整个实验系统或校准实验结果,需要设置内参(一般指由管家基因编码表达的蛋白)。4.为了确保western blot结果的准确性和特异性,设置合适正确的对照是必不可少,一般需要设置的对照如下:阳性对照:明确表达检测蛋白的组织或细胞,用于检测抗体的工作效率;阴性对照:明确不表达检测蛋白组织或细胞,用于检测抗体的特异性;二抗对照:不加一抗,用于检测二抗的特异性;内参对照:检测标本的质量和二抗系统空白对照:不加一抗和二抗;用于检测膜的性质和封闭的效果。转膜(Western blot 成败的关键)用于western blot的杂交膜主要有两种:NC膜和PVDF膜,可依据目的蛋白与膜的结合能力及膜的孔径来挑选不同的转移膜。两个膜之间的比较:转膜方法:分为两种湿转法和半干法经验总结:1.胶在负极,膜靠近正极;滤纸不要大过膜,防止短路;2.夹好膜和凝胶后,确定在凝胶、膜和滤纸之间没有气泡存在,否则会导致转膜不完全。3.注意一定要戴手套或塑料镊子接触膜,避免手上的蛋白和油脂降低转膜效率。4.转膜过程中,尤其是高电流快速转膜时,通常 会有非常严重的发热现象,最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。5.对于湿转法:一般转膜的电流在200mA-400mA之间,转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。大片段的>50KD的可以选用350mA,小片段的可以用250mA。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的转膜时间越长,目的蛋白的分子量越小,需要的转膜时间越短。免疫印迹经验总结:1.常见的封闭液有5%脱脂奶粉、BSA和Western Blot膜封闭液(生物试剂公司提供)。但是封闭液的选取具体得看抗体说明书,有的抗体是明确要求只能用BSA,而封闭液浓度的选择也是具体得看抗体的要求,但是一般情况5%BSA会比5%牛奶的效果好。2.选择抗体时,一方面需要考虑所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白,另一方面需要考虑所选抗体是否会引起交叉反应条带。WB结果定量分析WB做完后,有时需要对结果进行定量。然而最备受推崇的定量分析软件Quantiy One软件因其高昂的售价令很多人望而却步,但除了该软件外还有一个比较简单的图像处理软件ImageJ可以很方便的进行灰度和密度分析。ImageJ的软件界面1.ImageJ对WB条带进行灰度分析1)File|Open打开WB结果图片2)图片类型设置:Image|Type|8bit3)去除图片背景:Process|Subtract Background在Subtract Background窗口按照以下条件进行设置:4)设置定量参数:Analyze |SetMeasurements,点击Area,Mean Gray Value及Integrated Density5)设置单位: Analyze|SetScale,在“unit of length”的方框里输入“pixels”6)将图片转换成亮带,Edit|Invert7)选择Freehand Selection,尽量把条带圈起来,点击键盘m,出来IntDen灰度值8)复制数据IntDen进行分析2. Image J 对WB条带进行密度分析1)步骤同前,File|Open打开WB结果图片2)如果条带不正,需修正Image transform rotate调节angle值,直到条带水平为止3)选中矩形选项,圈中第一个条带,AnalyzeGels Select Firstlane(快捷键Ctrl +1),然后移动第一个条带上的矩形到第二个条带上,Analyze Gels Select Second Lane(快捷键Ctrl+2),最后Analyze GelPlotlanes4)选中直线工具,将开口的波峰关闭5)选中魔棒工具,点击波峰可以显示波峰下面积,即条带的密度值6)以第一个数值为基数,其他数值与第一个数值的比值即为相对密度。WB疑难杂症最后,别忘了领取protocol资源和免费PCR实验训练营名额,标书、实验、论文都不愁。部分截图:1不同研究水平实验技术protocol针对不同研究水平的同学,我们提供不同的实验技术Protocol,帮助科研er解决实验屡战屡败难题,拓展研究思维并发展未来研究新方向。入门↓↓↓初级↓↓↓中阶↓↓↓不知如何有效设计引物?PCR电泳无扩增条带?扩增产物不符合要求?条带总和你玩“捉迷藏”?……加入解螺旋的【一周学会PCR】医学SCI实验训练营,5节课帮你快速攻克以上难关!l 课程涉及抽提细胞RNA、反转录、PCR物设、Blast引物验证、引物库使用及引物评价和修改,零基础学员亦可快速掌握实验精髓;l 从原理、流程、试剂盒到注意事项,各个要点皆事无巨细,100%玩转PCR实验l 实验结果全面解读,5分钟内挖掘结果关键信息,快速产出符合SCI的结果图;l 分享实验小技巧,针对疑难杂症对症下药,攻克实验难题避免实验过程手忙脚乱;l 快速提炼文献中实验信息,学习相关实验技能,快提炼出独属于自己的实验方案。你将掌握↓↓1.从文献提炼实验套路的能力还原文献场景,复现材料方法和结果部分写作套路2.快速通关PCR学会用软件设计引物实验,掌握PCR实验详细步骤,提高PCR实验效率3.实时解决实验疑难杂症细节决定成败,实验细节的讨论,避免实验中的手忙脚乱解螺旋高级讲师猫大老师手把手带大家从原理到流程再到注意事项理顺实验操作,各个要点皆事无巨细,新手小白也能快速掌握实验精髓!讲师介绍猫大,中国科学院上海生命科学研究院博士,现于上海交通大学医学院从事博士后研究工作,主要研究方向为表观遗传与基因转录调控。猫大硕士毕业后曾在技术公司担任实验室主管,又经博士阶段系统科学训练,实验技能极为丰富全面。亲自操刀了《酸谈实验室》课程,手把手地教学学员细胞、分子生物学实验实操技巧。授课风格严谨务实、活泼可爱,带领学员走出实验迷雾。在一周学会PCR医学SCI实验课中,不仅有细节慢慢的实验经验总结,还有亲身示范实操过程,直观真切、通俗易懂,让实验小白也能轻松掌握!加入训练营,你还将知道——PCR产物出现假阳性(即空白对照出现目的扩增产物)怎么办?PCR产物中出现假阴性或无扩增产物(即阳性对照中有条带,而样品则无条带)怎么办?提高PCR特异性的策略有哪些?克隆PCR产物的最优条件是什么?没有回收到目的片段,需要做什么对照实验?对照实验结果好,却没有回收到目的片段,实验出了什么问题?猫大老师全程教学;实时解疑答惑;关键是还免费!点击下方链接即可学习知乎专属福利从知乎报名加入训练营的小伙伴,还能获得一份protocol资源,标书、毕业论文都能用上。包括:不同研究水平实验技术protocol1400页常见细胞动物实验技术总结不同实验方法全流程表型确认WB实验流程、注意事项、数据处理及写作IHC实验流程、操作技巧、注意事项、图像分析等编辑于 2022-12-30 19:03赞同 70添加评论分享收藏喜欢
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实验员小哈&Western blot 关于Blocking(封闭)的一些心得 - 哔哩哔哩
哈&Western blot 关于Blocking(封闭)的一些心得 - 哔哩哔哩 实验员小哈&Western blot 关于Blocking(封闭)的一些心得实验员小哈关注专栏/实验员小哈&Western blot 关于Blocking(封闭)的一些心得实验员小哈&Western blot 关于Blocking(封闭)的一些心得
2020年08月24日 23:57--浏览 ·
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实验员小哈粉丝:10.2万文章:11
关注又来填坑了。在我的western blot操作视频中,使用了一个神奇的成品blocking buffer,室温15分钟,封闭就做完了,封闭效果也不错,关键是省时间。可是,如果实验室没有成品buffer可以用,怎么办?通常,是用1X TBST配制5%的脱脂牛奶,室温,1~2小时。或者用1X TBST配制5%的BSA,室温,1~2小时。封闭结束后,用5%的BSA配制一抗稀释液,4度,过夜。赶时间的时候,可以试试37度,封闭半小时。不赶时间,或者做到封闭这一步的时候,天色已晚想下班,可以4度封闭过夜。---------以下是trouble shooting讨论--------背景高,排除了抗体因素,高度怀疑是封闭不全的情况,解决策略:放弃省时间的想法,优先尝试4度封闭过夜这个条件。换用不同的封闭剂。背景过于干净,条带弱,排除其它因素,怀疑是封闭过度的情况,解决策略:将1X TBST换成不含Tween-20的1X TBS来配制封闭液。降低牛奶或BSA的浓度。减少封闭时间。(这条不是很推荐。)换用不同的封闭剂。不过,,,封闭过度的情况不是很常见,不应该作为条带弱的时候优先考虑的情况。今天还是要祝大家的Western blot顺利!欢迎提出、讨论更多的关于Western blot的问题~本文为我原创本文禁止转载或摘编
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western blot 的原理是什么? - 知乎首页知乎知学堂发现等你来答切换模式登录/注册实验分子生物学医学生物实验生物western blot 的原理是什么?关注者257被浏览534,143关注问题写回答邀请回答好问题 14添加评论分享31 个回答默认排序酸菜科研等 2 个话题下的优秀答主 关注Western blot,中文为蛋白质免疫印迹试验,简单来说是抗原抗体特异性结合。电泳分离后的蛋白转移到固相载体PVDF膜上,以共价键的形式吸附蛋白质,并作为抗原结合特异性抗体。二抗作为显色标记,经过底物显色反应组织和细胞中蛋白的表达情况。蛋白提取1. 组织蛋白提取相对于细胞而言,组织蛋白的提取对技术和外界环境要求会更高一些。因为我们养的细胞很多是根据具体实验选择的特定细胞,而组织大多是为了丰富体内实验的各种蛋白的混合体,目的蛋白的含量并不一定充分,而且其中还包含着丰富的蛋白酶、血液或者脂肪等干扰因素。所以个人认为,提取组织蛋白一定要做预实验,这是很有必要的。可以摸清楚每次应该取多少重量的组织,什么样的离心条件可以去除血液和脂肪的干扰。比如像心脏、脾这类血液较多的组织,剪成米粒大小的小块儿后,加入适量PBS(PBS:PMSF=100:1,PMSF为苯甲基磺酰氟,蛋白酶抑制剂,30min内会降解一半,因此每次提取蛋白要加新鲜的PMSF),7500g离心力,离心5分钟,去上清。如果感觉血液还是很多,可以重复上述步骤数次。蛋白提取的全程要在低温环境下进行,以防止蛋白降解。30mg的组织对应500ul的RIPA裂解液(RIPA全称为Radio Immunoprecipitation Assay,RIPA:PMSF=100:1),置于冰上,使用研磨棒或电动组织研磨器充分研磨30分钟,再置于冰上静止30分钟。在12000rpm转速下,4度离心15分钟,取上清,测蛋白浓度。2.细胞蛋白提取细胞蛋白的提取相对来说耗时会少很多,只是在贴壁细胞和悬浮细胞的处理方式上略有不同。对于贴壁细胞而言,去除培养基后,用无菌预冷的PBS清洗3次,每次3分钟。对于像6cm的培养皿,我习惯每次加100ul的RIPA裂解液(RIPA:PMSF=100:1),转动培养皿,让裂解液接触到整个皿面。之后用细胞刮刀将皿里的细胞刮刀一侧,冰上静置15分钟后,在12000rpm转速下,4度离心15分钟,取上清,测蛋白浓度。对于悬浮细胞而言,吸出培养皿中的培养基,按照传代时离心力大小和时间进行离心。离心结束后,小心的倒掉上清,加入100ul的RIPA裂解液(RIPA:PMSF=100:1),冰上静置15分钟后,在12000rpm转速下,4度离心15分钟,取上清,测蛋白浓度。3.测定蛋白浓度蛋白浓度的测定一般选用BCA工作液(bicinchoninic acid),BCA工作液作为一种稳定的水溶性复合物,可以与二价铜离子结合,产生紫色复合物。562nm波长条件下测定吸光度,制作标准曲线,吸光度与蛋白浓度成正比。4.蛋白变性根据蛋白的体积,计算加入多少体积的1*loading buffer,煮沸5分钟即可。Loading buffer中主要含有溴酚蓝、二甲苯氰和甘油。前两者起到指示作用,甘油起到沉降蛋白的作用,以防加样时蛋白飘出。电泳1.制胶根据目的蛋白的分子量大小选择不同浓度的分离胶,8%、12%和15%三种浓度的分离胶就完全可以搞定日常蛋白的测定。一般测定100kDa分子量以上的蛋白可选择8%浓度的分离胶;测定20kDa分子量以下的蛋白可选择15%浓度的分离胶,中间的分子量可选用12%浓度的分离胶。有的时候蛋白跑不出来,其实未必是分离胶浓度选的不好,也有可能是marker的问题。marker起到的是蛋白分子量指示剂作用,但是要根据蛋白分子量选择合适的marker。一般的marker分子量范围在10-130kDa之间,都可以满足正常蛋白的需要。但有些分子量范围较广的marker,比如说6-250kDa,虽然说它范围很广,可中间的蛋白分子量并没有区分的很细,只适用于大分子或小分子蛋白,而对于30-70 kDa的蛋白并不是很适用。2. 电泳条件个人使用的条件一直是80V,300mA跑浓缩胶,120V,300mA跑分离胶,恒压电泳。当然了,这个电泳条件不是固定的,也有人选择恒流跑电泳。个人认为恒流和恒压对电泳的效果影响没有什么区别。因为配胶的成分中SDS起到的作用是破坏蛋白质分子和其它物质分子之间的非共价键。解聚后的蛋白质分子与SDS形成的复合物带有负电荷,远远超过蛋白质本身的电荷量,所以就不存在不同蛋白质分子之间的电荷量不同造成的影响了,恒压或恒流都只是起到推动作用。至于浓缩胶和分离胶的条件不同,我想这一点大家应该都很清楚了。浓缩胶中的孔隙较大,起到的作用是为了让蛋白质混合物在进入分离胶之前都到达同一起跑线,以便在分离胶中更好的分开,因此一定要充分跑完浓缩胶之后再调电压。转膜转膜分为湿转和干转。湿转就是把三明治结构放在转膜液中进行;干转,其实应该是半干转,虽然不放在转膜液中进行,但是滤纸也要事先泡过转膜液。有人说,湿转主要用大分子蛋白质转膜,半干转主要用于小分子蛋白质转膜,但是个人认为湿转就完全可以搞定大小所有分子量的蛋白,而且从转膜稳定率来说要好于半干转。所以个人习惯于用湿转。一般情况下的转膜条件是220V,300mA,转膜时间是1小时20分钟。对于10-180kDa分子量的蛋白,这个条件是完全可以的。虽然网上有很多人说小分子量的蛋白需要缩短转膜时间,或者改变电压电流,但是本人试过用这个条件转8kDa的蛋白质,一样没有问题。相反的,我缩短了转膜时间,或者改成了100V,300mA的转膜条件,转膜的效果反而不好。所以个人认为,转膜效果的好坏除了要考虑机器本身设定的条件外,还需要考虑一下其他因素。有很多新手用完转膜液忘记放回4度冰箱,时间久了,转膜液的离子成分就会发生改变,影响转膜效果;或者是滤纸使用太久了,也会影响转膜效果;又或者是要研究的蛋白自身性质决定的。Western blot并不适用于所有的蛋白,对于检测一些分泌型的蛋白,ELISA会更适合,所以也并不是说蛋白实验一定要用Western blot。发光选用ECL发光液发光。ECL发光液分为A液和B液,按照1:1的条件混合配制。洗膜结束后,倒出多余的TBST,但是也要在洗膜的塑料盘中留有一些,防止PVDF膜干掉。基本上1ml的工作液可以覆盖10cm3,发光的效果与发光液的新鲜程度有关,所以要现用现配。ECL的发光原理是:发光剂中的鲁米诺被过氧化氢和HRP氧化,产生荧光,整个发光过程被增强剂增强了发光效果,可以将灵敏度提高到1000-100000倍,但是也会遇到猝灭的情况,除了成像机器老化的原因外,也与发光液的新鲜程度和一抗二抗的浓度有关。质量好的发光液配合着合适的一抗二抗浓度,才能快速完美的发光。小于1分钟的发光时间固然是我们所向往的,但是碰上信号低的蛋白,我们也要想尽办法让它们显示出结果。对于信号弱的蛋白条带,我们可以手动调整发光时间少一些,比如说10sec,快速曝光比延长曝光时间的显影效果更好。用各种软件处理分析蛋白条带1.Photoshop CS6PS软件在后期投稿整理图片方面会有很大作用,这里我想说的是利用PS改变条带的对比度,减少后续利用Image j对蛋白灰度值进行测定时的干扰。正常机器发光之后的图片,背景都会泛蓝,我们可以选择PS软件中,图像-调整-去色,把条带背景统一调成灰色后再测灰度值。2.ImageJ利用Image j测量蛋白灰度值的方法,我想大家都很熟悉了,我就不详细的列出每一步了。这里想提到一点,BCA测出的蛋白浓度有时会存在一定的误差。我们在测蛋白标准曲线时,得出的R值肯定是9越多越准确,但是实验过程中,我们往往只有一或两个9,导致内参发出来的效果也是各组略有差异。为了追求完美,我们可以通过内参的灰度值进行作比,以一个组的蛋白浓度为定量,适当调整其他各组上样量即可。知乎专属福利;助大家一臂之力、我为大家准备了一份基础实验protocol,细胞侵袭、细胞凋亡、细胞黏着、细胞周期等,不仅有细胞培养相关实验,还有包括不同研究水平实验技术Protocol,不同实验方法全流程,WB实验流程、注意事项、数据处理及写作、IHC实验流程、操作技巧、注意事项、图像分析等相关实验的详细步骤,全都是经过前辈们无数次验证过的,希望对大家的实验有帮助。点击下方链接可扫码添加酸菜老师助手,知乎私信不回问题:中国临床医生科研成长平台;小助手会免费赠大家一门医学SCI从入门到精通学习营,添加即送!编辑于 2023-04-14 17:22赞同 41318 条评论分享收藏喜欢收起科研根号三实验室多年经验分享 关注刚好最近做完了实验,实验室要带师弟师妹做western blot实验了,western blot实验相关的经验总结写了几个晚上,这里一起分享给大家,刚入门的同学可以多看看~Western Blotting技术是将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,转移到固相载体(例如纤维素薄膜)上,利用抗原抗 体反应来检测目的蛋白的方法。如果整个实验过程中每一个实验步骤都能成功,就可以获得很好的实验结果。 除了对Western Blotting实验操作流程,对各步骤的操作方法和注意事项进行了通俗易懂的说明和介绍。 这里也会对实验操作中遇到的各种问题给出解决方法。Western blot实验教程大全,里面有实验的视频操作教程~额外分享:有需要的小伙伴可以自行下载~免费,亲测安装!56个科研人必装软件安装包 (11月更新)实验数据/图片处理+文献管理+科研绘图+写作翻译+统计分析+办公常用链接:https://pan.baidu.com/s/1JkjM67dHoKsY3K5AkLGrTg?pwd=6868 提取码:6868 一、Western Blotting检测的操作方法和注意事项觉得有用的话记得小手双击屏幕点个赞同❥(^_-)二、Western Blotting 实验问题及解决方案问题1:有污渍或斑点,整体背景普遍偏高问题2:出现白色条带问题3:出现非特异性条带问题4:信号弱或无信号Western BLoT Immuno Booster(制品code T7111A)可有效改善结果。 Western BLoT Rapid Detect v2.0(制品code T7122A) 可有效改善结果。 问题5:膜上部分无信号问题6:条带扩散三、Western Blot中结果条带的各种稀奇古怪结果图解析1. 啥也没有原因:比较多,如果单纯一张没有任何显色的X光片,最可能是一抗加成其他抗体,或者二抗种属加错了,比如兔的加成鼠的。解决办法:仔细检查抗体是否加错,确认转膜没有问题。经验:上面的图片展示的是一点信号都没有,如果是这样大部分情况是抗体加错了。如果中间出现了细微的条带,可能原因是蛋白上样量太少,一抗浓度过低,ECL发光液失效。另外如果转膜出现了问题,比如膜放反了,自然是一个白片。2. 高背景原因:封闭不够好,一抗浓度高,洗膜时间和次数不够解决办法:降低一抗浓度,增加洗膜时间和次数。经验:高背景可能是WB中最常见出现的问题,目的条带单一清晰,但是其他地方又弥漫性较为均一的背景(比较连续的)。其实只要我们注意操作规范,不偷工减料就很容易避免,洗膜按照规定来5min*5次或者10min*3次,不要改成5min*3次,或者10min*2次。3. 非特异性条带原因:一抗非特异性与蛋白结合解决办法:更换一抗经验:此种情况绝大多数是因为一抗不好,你无法判断那一条是目的条带。如果实在没有更好的抗体,建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。当然这种情况下有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。4. 条带中出现边缘规则的白圈原因:电转中膜和胶之间存在气泡。解决办法:转膜前去掉膜和胶之间的气泡经验:我们常常将电转液倒入一个盘子里,倒入的液体不能太多也不能太少,最好的高度是与放上第一层滤纸齐平,然后往滤纸上浇点转膜液,把电泳胶用清水清洗下,将电泳胶平铺到滤纸上,仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡,可以左右前后观察,不同方向观察之后确认无气泡,然后再往胶上面浇点电转液,用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧中间,使膜成U型,然后将U型的底部接触胶的中间,慢慢往两边放下膜,这样一般气泡很少。然后上层滤纸同样用U型的放置方法,用玻璃棒稍微贴实下,然后盖上海绵。注意不要来回赶气泡,这样反而会带入气泡。5. 条带中间出现白色(反白)原因:中心部位高浓度HRP把底物消耗过快,中间部位底物消耗结束之后就不发光了解决办法:降低蛋白量,降低一抗和二抗的浓度。经验:如果你足够迅速,可以在中间部位底物消耗之前就把X光片给定影出来,但是时间很难把握,建议还是从降低蛋白量,降低一抗二抗浓度入手。6. 出现黑点和黑斑原因:膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合解决办法:封闭牛奶一定要纯,封闭结束之后要洗经验:我们常常是等到要封闭的时候发现没有牛奶,然后匆匆忙忙用PBST/TBST配置,配的匆忙的时候往往不管是否已经完全溶解,如果没有完全溶解的情况下加牛奶倒膜上,会导致很多不溶性颗粒附着在膜上,这就会导致发光时候膜上的黑点。所以牛奶溶解之后,最好静止一下,然后轻轻地吸取上层牛奶进行封闭,封闭结束之后一定要洗三遍之后再加一抗。7. 条带拖尾原因:蛋白量太大,一抗浓度和时间太长解决办法:根据情况调整蛋白量,同时一抗浓度和时间也可以缩短。经验:这种情况很容易出现,因为很多原因都可能导致这一个结果。一般来说,蛋白量都是我们经过很多次摸索得出的最适蛋白量,因此不太可能是蛋白量过多引起的。最有可能的是因为一抗浓度太高,作用时间太长引起的。另外洗一抗和洗二抗千万不要偷工减漏,建议5min*5次,不要但是洗这么多次就把抗体和蛋白洗掉了,你又不是拿刀在上面刮,真正的抗原抗体的结合是通过这种方式洗不掉的。8. 出现重影原因:荧光强度比较高,在压片时,放好之后不小心又轻微移动了一段距离解决办法:X光片放上去之后,就不要动了,即使放歪了也没关系。经验:有的时候出现重新刚好在上下位置,并且重影会相对弱一些,不要误以为抗体识别了该蛋白的另外一种异构形式。9. 出现非均一性背景原因:膜可能曾经干过解决办法:在每一步的操作过程中,都需要注意不要让膜干经验:在封闭的时候,洗一抗,洗二抗,以及发光的时候都时刻需要注意蛋白面不要风干,风干之后结果很可能就是这个样子。注意与高背景区别。10. 某个条带变形原因:SDSPAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒解决办法:配胶过程中要小心,使用无杂质的液体。经验:很多实验室中使用的不是最新的设备,比如配胶用的海绵垫,如果用了很多年之后,会从下面往上面漏小气泡,当气泡足够小并且胶快凝固的时候,走到中间的小气泡就停留在胶内,并会影响到后面的跑胶。另外配胶用的水,SDS,Tris缓冲液要注意不要有杂质。11. 条带呈哑铃状原因:配置胶有问题解决办法:把胶配好,不合格的胶坚决不用经验:出现哑铃最大的可能是胶没有配置好,胶凝固后不均一,不知道大家有没有出现如下的配胶情况,下图中示意拔完梳子之后的结果,如果你拔完梳子之后出现图中下面部分的样子,多半会出现哑铃状。另外还有一种可能是样品中含有太多杂质,没有离心下来,然后杂质沉积在孔的中间,蛋白自然被推挤到两边。12. 最边缘条带弯曲原因:电泳电流不均一解决办法:换用新的电泳槽; 不使用两边的两孔经验:一般我们使用的是10孔的的胶,如果你上样刚好10个孔,那么最两头的两个孔肯定会歪曲。另外上样最好在胶的中间,这样电场均一。13. 其他问题(1)蛋白分子量偏高或者偏低。可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应,比如说100KD的蛋白你用12%的胶跑,或者说20KD的蛋白你用6%的胶跑。(2)蛋白质降解。蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带,然后会出现一些其他带,最主要特点是所有的条带比正常的都低,并且条带模糊不清晰。(3)所有条带连成一片没有间隔。原因最可能是上样量过多,其次是样品弥散(比如电泳长时间停止样品弥散)。14. 电泳过程中出现现象及问题(1)整个条带呈 “ ︶ ” 状:凝胶冷却不均一,电泳槽老化。(2)整个条带呈“ ︵ ”: 凝胶左右两头没有凝固好(3)溴酚蓝拖尾:样品溶解不好。(4)纵向的纹理:上样样品中存在不溶性颗粒(5)溴酚蓝很粗:浓缩胶浓缩效果不好,可能是浓缩胶太短,或者是浓缩胶配错。(6)在分离胶中跑不动:Tris-Cl PH值不对,或者忘记加SDS。有时间再把一些经验分享给大家,今天就先到这里~点个赞同,祝你实验顺风顺水~推荐内容绝密!2023年国自然立项清单表可下载(生命科学部+医学科学部),附往年1000+份中标标书!如何查看国家自然科学基金的的摘要和下载结题报告? 有哪些好用的zotero插件?有什么适合药学/生物方向科研小白的简单易学的科研绘图工具?有没有什么很好的科研作图软件?顶级图像分析软件,Image J、Fiji、Image pro plus,一次帮你搞定! NoteExpress和EndNote相比哪一个更好用?(附安装包)2023年更新!EndNote X9永久激活版本(序列号激活),最稳定,可汉化!写的太全了,Endnote 插入文献以及调整参考文献格式,这是知乎上最好的教程!太牛了!Zlibrary回归,这里有最稳定的访问指南!western blot是为了什么?如何学习和记忆细胞信号通路?最值得推荐装!GraphPad Prism 9.3 ,功能更多!SPSS 27 安装激活,授权日期到期时间2037年编辑于 2023-12-19 15:33赞同 110添加评论分享收藏喜欢
Western Blot详解(原理、试剂、步骤及问题解答)-丁香实验
ern Blot详解(原理、试剂、步骤及问题解答)-丁香实验48小时,有问必答丁香实验,轻松科研已收录 10000+ 实验48小时,有问必答丁香实验,轻松科研已收录 10000+ 实验48小时,有问必答登录提问提问我要登录|免费注册丁香通首页|Western Blot详解(原理、试剂、步骤及问题解答)点赞收藏分享Western Blot详解(原理、试剂、步骤及问题解答)互联网2021-09-103507Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。深圳子科生物技术部主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、 原理与 Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝 酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗 体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋 白水平的表达。二、分类western显色的方法主要有以下几种:i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现 常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行, 操作也比较简单,原理如下(二抗用HRP标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。三、主要试剂1、 丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺,应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N,N’-亚甲双丙 烯酰胺储存液丙稀酰胺29g,N,N-亚甲叉双丙稀酰胺1g,加H2O至100ml。)储于棕色瓶,4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0,因可以发 生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月,隔几个月须重新配制。如有沉淀,可以过滤。2、 十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS,1mlH2O去离子水配制,室温保存。3、 分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合,加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。4、 浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中,用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备,再用HCL调节PH值,而不用 Tris.CL。5、 TEMED原溶液N,N,N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时,聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml,临用前配制.6、 SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml,甘油6.4ml,10%SDS 12.8ml,巯基乙醇3.2ml,0.05%溴酚蓝1.6ml,H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合,在沸水终煮3min混匀后再上样,一般为20-25ul,总蛋白量100μg。7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris,188g甘氨酸,10gSDS,用蒸馏水溶解至1000ml,得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。8、 转移缓冲液:配制1L转移缓冲液,需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS,并加入200ml甲醇,加水至总量1L。9、 丽春红染液储存液:丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸 30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。10、 脱脂奶粉5%(w/v)。11、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒,戴手套操作),溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。12、 Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5),500mmol/LnaCl。13、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、 过氧化物酶标记的第二抗体。15、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺,75mg/ml)。16、 BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺,50mg/ml)。17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。18、 100mmol/L NaCl。19、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5),5mmol/L EDTA。(可以参看分子克隆)四、主要步骤生物秀为您搜集了现阶段几乎网上所有的Western Blot的中英文资料,仅供实验参考,可以根据自己实验的实际情况进行调整:五、 实验常见的问题指南根据问题的类型主要分成以下几类(以下资料权作参考,请勿盲目模仿!):1. 参考书推荐A. 对初学者看什么资料比较好?解答:《抗体技术实验指南》和Antibodies(a laboratory manual, wrote by Ed Harlow ,david lane)两本书不错。2. 针对样品的常见问题B. 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot (以下简写成Western Blot),提取线粒体后冻存(未加蛋白酶抑制剂),用的博士德的一抗,开始还有点痕迹,现在越来越差,上样量已加到120μg,换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗?解答:怀疑是样品问题,可能是:1,样品不能反复冻融;2,样品未加蛋白酶抑制剂。同时,建议检查Western Blot过程, 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说,一般加PMSF就可以了,最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。C. 细胞水平要做Western Blot,多少细胞提的蛋白够Western Blot?解答:一般地undefined 106就足够了。D. 同一样品能同时提RNA又提蛋白吗,这样对Western Blot有无影响?解答:能,没有问题,我们做过。E. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗?解答:当然可以,有的甚至可以同时测几十种样品。F. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白,操作需要注意什么?解答:如果是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂就要温和得多,这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。G. 我的样品的蛋白含量很低,每微升不到1微克,但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上,就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在,只是颜色变淡了,有什么办法可以解决?解答:你可以加大上样量,没有问题,还有转移时你可以用减少电流延长时间,多加5-10%甲醇。H. 想分离的蛋白是分子量260kd的,SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适?积层胶的浓度又该用多少?这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗?解答:260kd的蛋白不好做, 分离胶用6%, Stacking Gel 3.5%。I. 如果上样量超载,要用什么方法来增加上样量?如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。解答:可以浓缩样品,也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超载30%是不会有问题的。如果已经超了不少了,而且小分子量的也要,可以考虑加大胶的厚度,可以试试1.5mm的 comb。J. 蛋白变性后可以存放多久?解答:-80℃,一两年没有问题。最关键两条:不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。K. 我所测定的蛋白分子量是105KD,按理说分离胶应当采用7.5%,但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11%的配方,不知为何?解答:上述您提到的两种凝胶均可以使用,因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内,但需注意条带位置。L. 接下来我准备采用DAB显色技术,二抗是生物素化的多克隆抗体,三抗是亲和素生物素体系,不知采用这样的方案后,封闭液是否要作调整,能否再用5%的脱脂奶粉呢?好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成,是吗?解答:不能使用脱脂奶粉,因为脱脂奶粉中含生物素,用BSA代替应该好一点.M. 还有一问题,一般一次上样的蛋白总量是多少,跟目的蛋白的表达量有关系吗?解 答:Western Blot一般上样30-100微克不等,结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系,也与显色时间长短有关。开始摸条件时,为了拿到阳 性结果,各个步骤都可以量多一点时间长一点,当然背景也就出来了。要拿到好的结果,如果抗体好的话比较容易,抗体不好的话就需要反复地试了,当然有的不适 合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。N. 做组织样品的western的时候,处理样品有什么诀窍吗?还有,您用过大牛血清做封闭剂吗?浓度如何?效果是不是比BSA好一点?解 答:必须进行研磨、匀浆、超声处理,蛋白质溶解度会更好,离心要充分,膜蛋白需用更剧 烈的方法抽提,低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强,需要注意抑制蛋白酶的活性(加入PMSF和蛋白酶抑制剂 cocktail),封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体,使用BSA也是不错的选择。O. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD,在做western要注意什么呢?解答:做200kd蛋白的Western Blot时要注意,分离胶最好选择>7%的;剥胶时要小心;转移时间需要相应延长;要做分子量参照(否则出现杂带不知道如何分析)。P. 有什么方法可以提高上样量?解答:可以浓缩样品;增大上样体积来增大上样量。Q. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白,膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机,有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法,42kd的蛋白分子量算不算大?解答:如是需要提取膜蛋白,(而不是只需要提取膜蛋白),可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白,用这个做Western Blot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd 不算大,也不算小,所以,可以按照一般的转移方法实施。R. 蛋白的上样量有没有什么具体的要求?解答:上样量要根据实验的要求来定, 如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等, 如果只是要定性,则没有太大的关系, 尽量多上就行了, 但是不要超过0.3μg/mm2。S. 一抗,二抗的比例是否重要?解答:比较重要,调整好一抗,二抗的比例,可以去掉部分非特异的本底。3. 抗体T. 做细胞信号传导,要做磷酸化某因子Western Blot,其二抗有何要求?解答:对二抗无要求,要看你实验条件来选择,一般推荐用HRP标记的二抗。U. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好,所以没做预试,怕费时间,用什么样的稀释度比较好呢?我用的ELL+plus试剂盒显色。转膜过夜,一抗孵育也是过夜的,若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。解 答:不同抗体,即使是同一公司的抗体,其最佳的抗体稀释度也是不一样的,需要你实验摸索。我觉得转膜过夜好像没有必要吧,转膜的目的也就是将蛋白转到膜上 就行啦,何必浪费时间呢。至于具体的转膜时间,还要看你的目的蛋白分子量的大小;转膜的设备,是半干式,还是湿式。一抗当然可以过夜,如果你想所短 Western Blot时间的话,可以增高一抗的孵育温度,我们实验室一般37度,两小时就足够了;你可以参照抗体说明书。至于一抗和二抗得稀释度,你可以一抗 1:1500;二抗1:20000试试。另外建议你洗膜时,多洗几次,最好是在封闭;一抗和二抗后至少是5x5min,跑一张好膜不容易,多尽点心吧,这 样不会浪费你的时间,只会节省你的时间!V. 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗?解答:免疫组化时抗体识别的是未 经变性处理的抗原决定簇(又称表位),有些表位是线性的,而有的属于构象型;线性表位不受蛋白变性的影响,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;构象型表位由于受 蛋白空间结构限制,煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和 Western,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。(限于单抗)W. Western Blot 中抗体的重复应用问题解答:抗体工作溶液一般不主张储存反复使用,但是如抗体比较珍贵,可反复使用2-3次。稀释后应在2-3天内使用,4度保存,避免反复冻融。4. 滤纸、胶和膜的问题X. NC膜\ PVDF膜\ 尼龙膜怎样鉴别?解答:尼龙膜是较理想的核酸固相支持物,有多种类型;硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物,价格最便宜;PVDF膜介于二者之间。就 结合能力而言:尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480-600μg/cm2,可结合短至10bp的核酸片段;硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达 80-100μg/cm2,对于200bp的核酸片段结合能力不强;PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125-300μg/cm2。就温度适应性而言:尼龙膜经烘烤或紫外线照射后,核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合;硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA,结合不牢固;PVDF膜结合牢固,耐高温,特别适合于蛋白印迹。就韧性而言:尼龙膜较强;硝酸纤维素膜较脆,易破碎;PVDF膜较强。就重复性而言:尼龙膜可反复用于分子杂交,杂交后,探针分子可经碱变性被洗脱下来;硝酸纤维素膜不能重复使用;PVDF膜可以重复使用。Y. 在做Western Blot时,PBDF膜用甲醇浸泡的目的?解答:PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合,做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。Z. 检测磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗?解答:可以。AA. 转膜后经丽春红染色的条带,为什么大蛋白分子的一端(即点样空的一侧)的转膜好象不是很好,为什么?解答:这是正常的,大分子的蛋白转移的慢, 你延长转移时间和电流,大分子一端就会好的多,但是小分子的就有可能会变淡。BB. 我想问您裂解细胞用三去污裂解法,还是用上样缓冲液?解答:用上样缓冲液,这样有几个好处,可以提取总蛋白,同时又可以让磷酸化酶失活。CC. 采用tank system有什么讲究?解答:建议低电压,长时间,(一般tank System 用衡压好点),如 28V 14-16hrs。DD. 做HSP WESTEN定量,同样的抗体免疫组化能做出,而WESTEN却不能?解答:这多半是抗体的问题,要看抗体的说明,是否能做Western Blot和IHC。EE. 膜一般要如何处理?解答:一般用甲醇泡泡就可以了。FF. 如果是6×8转印膜,要加多少一抗?解答:一抗的稀释度是有说明的,根据你的一抗看看就知道了,但是那么大的膜孵育体积一般最少为3-5ml。GG. 上下槽缓冲液有何要求,怎样才能达到最佳效果。解答:无要求。HH. 跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢?是有的成分不对吗?解 答:没什么问题,就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来,在里面加点水保持湿度就可以了。如果过夜,胶里的水分被蒸发,采用保鲜膜包上也可以; 也可能母液(30%聚丙酰胺)有问题,你可以重新配制一份观察;能够替换的试剂,尽量换一下,选用好的试剂,避免找问题麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会 造成胶缩。II. 膜、滤纸、胶大小有何讲究?解答:如果是用的是半干转,顺序为:阴极-》滤纸-》胶-》膜-》滤纸。滤纸的长宽分别比胶小1-2mm,而膜的长宽分别比胶大1-2mm。绝对禁忌:上下两层滤纸因为过大而相互接触,这样会短路,电流不会通过胶和滤纸。JJ. 蛋白质的分子量跨度很大,如要分离小21KD,中至66KD,大至170KD,可以一次做好吗?解答:这么广的分布不好转移,一般建议:21kd和66kd可以一起转,12%SDS-PAge, 湿转36V , 3-5hrs就可以了, 可以根据你实验室的经验调节;170kd 用7%SDS-page, 48V 10hrs-16hrs。KK. 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上, 转移效率低怎么样解决?解 答:可以考虑:转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度)(优化的转移缓冲液,可以参考《蛋白质技术手册》),因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率,但可增加蛋 白质和NC膜的结合能力,甲醇可以防止凝胶变形,甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间;转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS,也是为了增加转移效率;用优 质的转移膜,或使用小孔径的NC膜(0.2微米);使用戊二醛交联;低浓度胶,如低至6%。太大时还可以考虑用琼脂糖胶;提高转移电压/电流;增加转移时 间。LL. 如何选择最合适的蛋白杂交膜?解答:蛋白质印迹杂交是分子生物学实验中极为常用的一门技术。选择质量上层、合乎要求、方便适用的杂交膜是决定这项实验成败的重要环节。根据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小等等因素,我们要量体裁衣,从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选择。硝 酸纤维素膜:硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下,大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力 的结合在一起,虽然这其中的机制还不是十分清楚,但由于硝酸纤维素膜的这个特性,而且易于封闭非特异性结合,从而得到了广泛的应用。在非离子型的去污剂作 用下,结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小,要选择不同孔径的硝酸纤维素膜。因为随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量蛋白的结合就越 牢固。但是膜孔径如果小于0.1mm,蛋白的转移就很难进行了。因此,我们通常用0.45μm和0.2μm两种规格的硝酸纤维素膜。大于20kD的蛋白就 可以用0.45μm的膜,小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了,如果用0.45μm的膜就会发生“Blowthroμgh”的现象。从膜的质地上来 看,最重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量。硝酸纤维素膜的结合能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关,市场上有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋 酸纤维素,因而降低了蛋白的结合量。S&S公司采用的是100%纯度的硝酸纤维素,保证了最大的蛋白结合量,可达80-150μg/cm2。由于 100%的纯度,因而也大大减少了非特异性的结合,降低杂交背景,无需高严谨度的洗脱步骤。其次,膜的强度和韧性也是需要考虑的因素。常规的硝酸纤维素膜 比较脆,漂洗一两次就会破损,不能反复使用。PVDF转移膜:PVDF是一种高强度、耐腐蚀的物质,通常是用来制造水管的。PVDF膜可以结合蛋 白质,而且可以分离小片段的蛋白质,最初是将它用于蛋白质的序列测定,因为硝酸纤维素膜在Edman试剂中会降解,所以就寻找了PDVF作为替代品,虽然 PDVF膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高,但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品,一直沿用至今。PVDF膜与硝酸纤维素膜一样,可以进 行各种染色和化学发光检测,也有很广的适用范围。这种PVDF膜,灵敏度、分辨率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高,非常适合于低分子量蛋白的检 测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇进行浸泡饱和1-5秒钟。离子交换型转移膜:硝酸纤维素和PVDF膜是靠疏水作用结合蛋白的,还有一类膜 是根据离子交换的方式结合生物大分子的。由DEAE(二乙氨乙基)修饰的纤维素制成的DEAE阴离子交换膜同样可以 作为蛋白质印迹的固相支持物。DEAE可以有效的结合阴离子基团,包括那些高于其等电点的蛋白质。在pH10以下,DEAE基团都能带电荷,在低离子强度 的转移液中结合蛋白分子。其最适的pH环境为5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血红蛋白的研究。这种0.45μm孔径的DEAE膜,除了 可以做Western Blotting外,还可以用于核酸结合研究。还有一种离子交换型膜是羧甲基(CM)修饰的纤维素膜,它可以结合蛋白和多肽分子,以及其他的一些带正电荷的样品,最适结合pH范围在4-7。结合的多肽分子可以从CM膜上洗脱下来,用于氨基酸系列分析或微测序。5. Marker的相关疑问MM. 我用的是可视marker(BIO_RAD),但是电泳总跑不全8条带,请问什么原因?怎样改善?胶用过8%,10%,12%,都是这样。marker是新买的。解答:一般来说,是小分子量Marker跑走了,增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。NN. 用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd,75kd,45kd,30kd,20kd,10kd组成的marker。开始做Western Blot时还能够看到marker,当然也仅能看见其中最多三条带。用80V进行SDS-PAGE电泳,用恒压10V45min转印的。前几次做 Western Blot时没有进行丽春红染色,但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出现。再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时 在一块胶上进行分析,用培养基样品进行分析,没有用间接法,而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体(Anti-V5-HRP)。但就是出不来结果, 我很茫然。谢谢您过给予指点!解答:1、“我用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd,75kd,45kd,30kd,20kd,10kd组成的marker。开始做Western Blot时还能够看到marker,当然也仅能看见其中最多三条带。”有的时候,Prestained Marker 放久了效果就会变差,电泳是条带不清晰,扩散。但是你的问题可能还有其他的方面的问题,可能是蛋白跟膜结合的不紧密。转移是多加点甲醇。2、“前几次做Western Blot时没有进行丽春红染色,但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出现。”转移时半干法建议用恒流,你这样的也就30kd-50kd的转移地比较好。3、“再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析,用培养基样品进行分析,没有用间接法,而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体(Anti-V5-HRP)。”是否检测了表达量,二抗是否是好的,你做了阳性对照?你要做这么大的蛋白最好转移时间延长到1.5hrs。6. 染色的选择OO. Western Blot哪种染色好?解 答:(1)阴离子染料是最常用的,特别是氨基黑,脱色快,背景低检测极限可达到1.5μg,考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度,但脱色慢,背景高。丽春红S 和快绿在检测后容易从蛋白质中除去 ,以便进行随后的氨基酸分析。缺点是:溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。(2)胶体金,灵敏度高,检测范围可到pg级,但染色比稳定。(3)生物素化灵敏度位于1、2之间,可用于任何一种膜。7. 参照的疑问PP. 是否Western Blot实验半定量一定要加ACTIN内参?解答:对于发表文章的实验最好加内参,实验严谨。QQ. 用BANDSCAN分析结果行吗?解答:分析一般的结果没问题。RR. 核内抗原Western Blot内参选择什么合适?解答:可以选用组蛋白,组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的,有很多都可以当成内参,在网上查查就可以选出你要的内参。SS. 转膜时采用电流是否比电压准确,是否根据0.8mA/cm2,一般1小时左右?解答:不是的, 半干法推荐用恒流,一般根据目的蛋白的大小来确定电流和时间。TT. 做半定量人卵巢癌细胞系的Western Blot,内参B-actin,GAPDH,那个好?解答:选用beta-actin就可以。8. 缓冲液配方的常见问题UU. 转膜后的脱脂奶粉封闭时,所用的防沫剂A是什么?还有Tris-HCl是不是就是用Tris和盐酸配出来的呢?解答:转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉。Tris-HCl就是Tris盐用HCl调ph值,配置而成。VV. 准备做大鼠脑子的Western Blot,蛋白质位于细胞核中,请问此蛋白质的提取液及操作方法是?每一步都必须要低温吗?这种蛋白质是磷酸化的蛋白质,操作时如何防止去磷酸化的发生?解答:可以用提取总蛋白的buffer提核蛋白,可以加NaF防止去磷酸化。WW. 想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗?受不受组织来源的影响?胞膜和胞浆有区别吗?解答:一般来说提取时加入光谱的蛋白酶抑制剂就可以了,操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法,一般来说都没有区别。XX. 最近作了两次Western Blot,不但没阳性结果,显色背景都没有,电泳和转膜都染过,有条带。底片和显色液及DAB显色液均试过,没问题。1、检测GAD--分子量67kd, 提取液有蔗糖,其余同三去污裂解液。蔗糖不会有影响把?样本--20度放置一周内测。2、一抗放置2年,可能效价不高!用的是 1:100。如果是一抗的原因,不会背景都没有把?3、第一次有不均匀背景,因为一抗过夜时密封袋不均匀。后两次无背景显色。4、封闭液用的是含15%脱 脂奶粉TBST,漂洗液用的是含1%BSA的TBST液,TWEEN-20为 0.1%,不会是封闭液的问题吧?解答:可以在下面几个问题上找找原因。1. 封闭液用5%Milk,漂洗液(washing buffer 用TBST)2. 看看一抗是否能work,降到1:20。3. 看看二抗是否有问题。YY. 加甲醇的目的是什么?解答:加甲醇起着一定的固定作用,因为小分子蛋白质容易转出去.(特别是在硝酸纤维素膜上,因为NC膜结合蛋白质的能力较弱)。ZZ. “转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”,其中TBST最后那个T是Tween吗,浓度多大?解 答:是Tween,配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), Dissolve 8.8g of NaCl, 0.2g of KCl, and 3g of Tris base in 800ml of distilled H2O, Add 500ul of Tween-20, Adjust the pH to 7.4 with HCl, Add distilled H2O to 1L, Sterilize by autoclaving.AAA. 封闭,一抗,二抗时的温度有没有什么规定呢,比如现在我就在室温里做,或者要在4度下?解答:均可在室温进行,如果时间不够,一抗孵育可以先在室温进行一个小时,然后4度过夜。BBB. 实验室暂无NP40我用sds可以吗?另外有过用尿素和硫脲提取膜蛋白吗?配方如下:7M 尿素,2M 硫脲,Triton-x-100 0.2ml,新鲜加入:65mM DTT蛋白酶抑制剂:试剂盒HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%(v/v) 是用于抽提双向电泳用蛋白的配方。不止用于抽提细胞全蛋白(主要是想得到其中的膜蛋白)是否可行?改 良的RIPA裂解缓冲液(Tris.HCl, 50 mmol/L, pH 7.5; NaCl, 150 mmol/L; NP-40,1%; 脱氧胆酸钠, 0.5%; SDS, 0.1%; EDTA, 1 mmol/L; PMSF, 1 mmol/L; Leupeptin, 2 μg/ml)不知对于膜蛋白效果如何?此外该方中的EDTA, 是否用做蛋白酶抑制剂?解答:做2-D绝对不推荐使用NP-40(因为即使进口的 NP-40也不纯,,其中的杂质会影响质谱结果)。对于动物细胞,其蛋白酶活性较弱(相对于组织和大肠杆菌等),可以不使用cocktail,因为7M尿 素+2M硫脲+4%CHAPS构成的变性环境已经足以抑制大部分蛋白酶的活性,2M硫脲+4%CHAPS对于抽提膜蛋白有很大的帮助,不过如果您专职做膜 蛋白建议采用分级抽提法。此外还可以采用梯度离心法和一些基于去垢剂的方法。EDTA用于灭活金属蛋白酶(主要是其鏊合作用)。加过多的蛋白酶抑制剂可以 导致蛋白质的修饰,做WB无所谓,做MAILDI时会给正确鉴定带来麻烦。裂解缓冲液中少了两性电解质(在2-D裂解缓冲液中,两性电解质起的作用:提供 连续的PH梯度,从很大程度上增加蛋白质的溶解性;还可以去除一部分核酸);也不推荐采用SDS,因SDS会与蛋白质结合导致其等电点发生改变,如果您实 在要用,终浓度降到0.1%以下。CCC. Western Stripping Buffer的配方解答:METHOD11、stripping buffer: 62.5mmol/l Tris PH6.7;100mmol/l beta-mercaptoethanol;2%SDS二次发光protocol:1.stripping buffer洗膜:50度水浴30分钟,摇床上摇10-20分钟。2、undefinedPBST洗:摇床上摇30分钟。3、封闭,加一抗,二抗(同第一次发光)METHOD2(50ml总量):?-mercaptoethanol 342 μl;20% SDS 5 ml;Tris-Cl pH 6.7 3.125 ml;加ddH2O至 50 ml。方法:将用过的膜浸入stripping buffer中,置50℃水浴箱中30min,间断振摇。之后用TTBS洗undefined5min就好。此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。该方法的优点:省事,省力,省钱,符合国际惯例。METHOD31、beta-metaptoethanol 35ul2、10%SDS 1ml3、tris (0.5M,pH6.7) 625ul4、dH2O 3.34ml50-55℃,30min。METHOD4stripping buffer应该是可以放置很久的。不过我习惯于现配——毕竟,加了β-mercaptoethanol 以后太难闻了,配了就用;而且,有了现成的Tris-HCl缓冲液和SDS的母液,现配还是很方便的。每次用量5ml少了点,我每次用50ml。METHOD50.5M NaCl,0.5M HAc;室温摇床15min。METHOD6将用过的膜泡在undefinedTBS中室温振摇过夜,中间可以换液2-3次,然后封闭,加一抗,二抗(同第一次发光),实践证明方法完全可行。不管用那种方法,洗脱后都要用PBS或TBS再洗几次。9. 条件的摸索DDD. 用的是Santa Cruz的抗体,也实验过一抗和二抗肯定能结合,二抗加DAB肯定能显色。电泳的胶用考马斯亮蓝染色没问题,但是不知道与Marker对应的条带是否是我 要的(我目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD)。半干法2小时转膜后,丽春红染色发现大分子量蛋白转过去的较少。难道是裂解液出了问题?我用的是三 去污剂,但没加叠氮钠和大概叫Apoptin的那种蛋白酶抑制剂。冰上裂解 -80度冻存的细胞,4度12000g离心5分钟,取上清,与分子克隆(第二版)上的加样buffer混合,沸水变性5分钟,上样。不知道是哪里出了问 题?建议:1、首先确定您提的蛋白质量如何?可用PIERCE公司的BCA试剂盒测蛋白的浓度,一般来讲,其浓度应该在几-20微克/微升。2、若是蛋白没问题,哪就看是不是电泳的问题,首先要看胶的浓度,您目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD,建议分别用10%和12%的胶。60-80V,1小时左右。跑过积层胶与分离胶的线时,换用100V,3-4小时。3、转膜,建议恒压,15V,不用转2小时,45分钟足以。您所说的大蛋白转过去的,并不是真正的少,而是因为在提的蛋白中大蛋白本身就很少。我曾经也转过2小时,但和45分钟的区别并不大。4、根据MARKER的条带(我的是7条带:14、18、25、35、45、66、116KD),您根据MARKER的条带剪下25与35之间(29KD)的条带,45-66之间(50KD)的条带。这样第一,可以节省抗体,第二,您要的目的条带肯定在上面。5、延长1抗、2抗孵育时间(我曾室温1小时,4度过夜),适当加大1抗浓度6、我买的也是Santa Cruz的抗体,我觉得质量还可以,我想您应该先找其他方面的原因。EEE. 电泳用的是恒流,一块胶,20mA,100分钟左右。转膜也是恒流,38mA,100分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应体系下做出来了,当然彼此的目的蛋白不同。所以,我想问题应该出在抗原和一抗上,不知对不对。解答:电泳的条件:样品的分子量决定了胶的浓度,一般使样品跑至胶的中部即可。正常条件下,电泳时溴酚蓝和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以决定电泳的电压和时间。建议你用恒压80-100伏。FFF. BIO-RAD的半干转运系统有一个很致命的弱点就是无法控温(我用的就是这种),当电流过高,而系统的散热又比较差,滤纸的吸水性比较差的情况下,就很容易烧胶。就 转膜时,是采取恒压还是恒流的问题,我想和大家探讨一下,我感觉我这个系统用恒流很容易烧胶,我的胶有68cm2,用50mA恒流来转膜,刚开始电压就很 高,有20 v左右,而用恒压,开始电流有110mA,但15min后,电流就降到8OmA,30min后就稳定在40mA,不就相当于恒流吗?解答:恒流时电压逐渐升高的原因是湿滤纸逐渐变干因而电阻逐渐增大的缘故,如果电压升得太快,可以使滤纸更湿一些以克服。就我的感觉,20V的电流30min以后20Kd以下的分子丢失很多,不过我用的是小胶40cm2,不知有无不同。GGG. 我想尽量提高转膜的效率(我的实验要求转到膜上的蛋白越多越好,不管是什么大小蛋白)不知道有那些办法?解答:不管怎么转都会存在蛋白转移不完全(电压过小时间过短)或过度转移(电压过大时间过长)的问题,鱼(小分子量蛋白)和熊掌(大分子量蛋白)不可得兼呵呵。建议把胶切成两半,比如以35KD为界,分别进行转膜,下半时间短,上半时间长一点,应该会好一些。HHH. 请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么?解 答:一般而言,硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联,这样的话,反复洗几次后,蛋白容易掉下来,结果较差。尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合 (注:常用的PVDF即带正电荷的尼龙膜),同时也有疏水作用,但相对较弱。这样的话,PVDF膜和蛋白接合较牢,不易脱落,结果较好。III. 1、煮好后的样品,若没有及时上样分离,应如何保存,可以保存多久?2、有没有人在用bio-rad的小型垂直电泳槽,有没有操作手册?3、湿式转移时是 否必须要用bio-rad的专用滤纸?4、恒压转移的条件如何确定,因为我要分离小至21KD,中至66KD,大致170KD的蛋白质,转移条件能够相同 吗?5、凝胶的浓度是不是可以用一个浓度?书上写不同的凝胶浓度分离的分子量范围不同,还给出了一个线形范围,是不是不在这个范围内也能分离,只是就不是 线性范围了?解答:1、煮好后的样品,放到-20,我们在一个月后此样品,效果一样。2、bio-rad的小型垂直电泳槽的操作手册在他们的主页Bio-Rad USA上有3、转移时一般的WATERMEN滤纸就可以。4、转移条件是和蛋白质大小有关的:以次确定电压和时间。具体可让ptglab帮你定夺。5、凝胶的浓度也是和分离蛋白质大小有关。不是随心所欲选的,否则分离效果可能不是你所期望的。JJJ. 怎样设计实验来确定最佳的条件?解答:随便说一点, 具体的还是需要自己想:1、在每个上样孔里上同样的蛋白样品,量也一样,最好是组织样,(也可以跑1 个大 well, 不插梳子,多上样,)SDS-page;2、转移, 设定电流或电压;3、每隔 1(or n) 小时,取一点膜染色,看转移效果。KKK. 我要测两种抗体,一种为磷酸化的目的蛋白,一种为总的目的蛋白,不知道用什么方法strip最好,我用甘氨酸(PH2.9)漂洗15分钟,似乎没什么效果?解答:你可以加巯基乙醇(loading buffer 一样的浓度),56度, 30mins,看看。LLL. 1、在用PBS洗涤抗原-抗体-ProteinA-Agarose复合物时,每次要重悬多长时间合适?2、最后用2xSDS重悬抗原-抗体复合物离心后, 由于2XSDS中已经加入了溴芬兰,因此下面的Agarose珠子几乎看不到,所以吸取上清加样时也不知道里面是否吸进了Agarose。不知有什么方法 可以解决这个问题,或者即使吸进了一些Agarose也不要紧呢?解答:1、不用重悬多久,重悬起来了就可以离心了。2、加2X BUFFER前大体上已经知道有多少胶粒了,吸到那个位置时小心点就是了。我也试过一些次,首先离心稍微长一点,长20秒吧,希望胶粒能沉得结实点(我想 象的),再吸取。如果感觉枪头不是很顺畅的时候可能就是碰到胶粒了。很难一点胶粒也吸取不上来的,尽力做好就是了。MMM. 磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等?解答:NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂,一般最好加。但是不加也可以,大部分时候是不用加的。我做的时候从未加过,都做出来了。NNN. Western Blot中block的最短时间?解 答:每一步1小时足够了, 中间换抗体要洗的话多换液几次,每次时间10分钟就够,洗3次只要半小时。跑胶1小时, 转移1小时,block半小时就行,1抗1小时,洗半小时,2抗1小时,洗半小时,显色10分钟。一般跑两块胶,一块染色, 一块western。一天肯定完事,一般不用等到第二天。OOO. 想用Western检测基因转染后细胞培养上清中表达的目的蛋白(定性),分子量为20KD,浓度约为几百ng/ml。蛋白样品需浓缩、纯化吗?如何浓缩、纯化上清液中的目的蛋白?对小分子蛋白Western blot时需特别注意哪些条件?解答:按照你提供的浓度,如果做Western Blot,是不用浓缩样品的. 对于20kd的小分子的蛋白,Western Blot中要注意的是:1、转移时的时间,2、转移时的电流或电压.3、transfer buffer 中加20%的甲醇4、可以用13-15%的分离胶.PPP. 蛋白分子量大小分别为21kd、28kd,用的是湿转,请问多大电流,多长时间比较合适?解答:分子量比较小,最好是用干转,湿转效率太高,易转过了。干转的话,用2.5 A/cm2, 30min就应该够了。湿转,按照bio-rad的说明,用100mA,也得要半个多小时吧。QQQ. 需要测同一种蛋白质的总量与磷酸化的量,但相互间干扰太大,怎么办?解答:将膜放入stripping buffer(SDS 2%,Tris·Cl (PH=6.7) 62.5mM,beta-巯基乙醇 100mM)中,50℃孵育30分钟,TTBS西三次,再重新加入一抗,进行另一种抗原的检测。RRR. 做Western Blot实验时,发现转膜时的电流总是偏小,转膜的效率也偏低. 100V恒压转膜时的电流只有190mA左右,而以前都有250mA。体系和条件都和以前一样,只是环境温度比以前低了很多。解答:有可能重复使用了转移缓冲液,随着离子的逐渐减少,电阻越来越大,当然恒压时电流越来越小了。建议更换转移缓冲液。反复使用不要超过三次。环境温度低是有利于转移的。SSS. 我电泳用的是恒流,一块胶,20mA,100分钟左右。转膜也是恒流,38mA,100分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应体系下做出来了,当 然彼此的目的蛋白不同。所以,我想问题应该出在抗原和一抗上,不知对不对。一抗我买的是单抗,推荐的稀释度是1:100——1:1000。我用的是 1:100。难道非要用多抗吗?按道理单抗也应该出条带呀!细胞用三去污剂裂解的,没有做定量,加巯基乙醇变性后,每孔上样20微升。提出的蛋白我保存在 4度了,这样行吗?解答:1、建议您用恒压进行电泳,先用70V,等跑过积层胶与分离胶的界限时,换用90-100V,再跑3小时左右。2、转膜 可用恒流,但要根据你的膜的面积及所要检测的蛋白的分子量的大小来确定电流的大小,一般来讲,0.8-3.0mA/CM2,分子量大的蛋白就用的电流大 些,譬如,你膜的面积是30CM2,蛋白的分子量是80KD,那么你就可以以2.0mA/CM2的条件进行,你就可以60mA的电流进行。3、我觉得你的 抗体应该没问题。4、你提出的蛋白怎么保存在4度呢?我们实验事都是保存在-20度的,提出蛋白分装保存在-20度。TTT. 目的蛋白是一种6KD的分泌性蛋白,RT-PCR就显示细胞中mRNA表达不高,估计将培养上清冻干浓缩后采用Western Blot还可能检测不出,但如果用western,是否一定要用0.2μm的膜?用Tris-tricine SDS-PAGE电泳,电泳时分别管制三层凝胶,分离胶用40%T丙稀酰胺(2.6%C)浓度为16.5%,另外两层都用30%丙稀酰胺,中间一层浓度为 10%,积层胶浓度为4%,凝胶厚度1mm,转膜的条件试过30V70分钟,膜上可见到小分子蛋白marker的条带,似乎见到目的条带,上样量为 60μg细胞胞浆总蛋白,转膜的条件怎么样合适?解答:一定要用0.2μm的膜,并且转移的条件要摸索一下,小分子的Western不好做,要根据你的实验器材来定,一般你要是有prestained marker就可以参照一下,如果相应的分子量大小的marker转移的好就可以了。UUU. 怎样才能把胶跑的非常漂亮,泳道和band都能很直,是不是上样的量很重要,罐胶有什么技巧吗?想跑漂亮,是不是应该先小电压,再高电压,总体上电压小些会跑的好些?还有前面有人说电泳液平玻璃板会使电泳条带漂亮些?解 答:影响跑胶跑的质量,有以下几个因素:1、电压,小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小,条带越漂亮,浓缩胶80v,分离胶100v就能跑 得很好。2、胶的均匀度,胶越均匀,条带越窄,分离越均匀。倒胶之前,一定要充分混匀,玻璃板一定要干净,双蒸水隔离时,一定要比较轻地加上去,避免稀释 上层的分离胶,使胶不均匀。VVV. 为什么提高大分子量蛋白的转移的时候,小分子量蛋白会丢失一些哪?什么原因?解答:小分子的蛋白在转移过程中,会透过膜去,所以大分子的上去以后,有一部分小分子的就透过去了。WWW. 上次转染了1.undefined106细胞,收集,收集到了400微升体积,加undefinedloading buffer, 95度煮5分钟,-20度,交替3次,离心,上样,7%分离胶,先80v跑进分离胶,在100v电泳至溴酚兰出胶,biorad半干转PDVF膜,15v 转30分钟,预染marker全部进膜,转移后的胶考马斯亮兰染,可见残留的蛋白带,大分子量多些.blot时,封闭用5%奶粉TTBS 1小时,抗体稀释液TTBS,一抗(1:10,单抗上清,2000年制备)1小时,二抗(1:2000)1小时,均在室温.结果,50kd的小分子显 色,160kd大分子未显色。原因分析及准备改进:转染大容量的质粒(融合蛋白的质粒)的效率会相对较低,大分子量表达也会相对较低,加上大分子 量蛋白的转移不完全,可能是我没有拿到大分子量条带结果的原因。另外背景稍微有一些脏(背景整体均匀一致),估计是二抗的浓度高了些,准备降至 1:5000,另外抗体稀释液准备改用5%奶粉TTBS,封闭改为室温2小时。这个过程有没有问题?解答:首先分析你的整个实验步骤。我发现了两个比较大的毛病:1、一抗用TBST稀释。按照我的理解,一抗最好用5%的TBST脱脂牛奶稀释,和你的封闭液相一致,这样可以降低背景。2、 “biorad半干转PDVF膜,15v转30分钟”,你是这么做的吗?因为我大部分时间是做的恒流转移,用的是0.1mA/膜,100kd-- 200kd转2小时。到最后电压会升到20v左右。你用恒压法,我不是很肯定你转30分钟能将大分子(160kd)的抗原转上去。我建议你最好能将时间延 长,如果是恒流,可按我的做法;如果是恒压,可摸索一下,适当延长时间。有时候你的marker也有可能欺骗你,因为marker的量比较大,是很容易转 上去的,实际上目标蛋白的量远远少于marker量。我对你的结果分析如下:1、你的结果很好,估计离目标不远了,很快就可以成功。2、 没有160kd的带是因为你的转移时间过短,适当延长转移时间(我怀疑这是主要的问题)3、你的一抗用1:10,2抗可以降到1:5000,背景会低一点。10. 方法的介绍XXX. 我想将hbx转到hepg2 细胞里 通过检测hbx蛋白的水平来 检验转染的效率 不知道可不可行?解答:Western Blot检测HBX蛋白的表达来检测转染效率不是一个好办法,建议还是:1、最好是带有荧光标签的HBX转染来看转染效率,最可靠2、其次,HBX和荧光载体共转染,相对说明问题3、荧光载体单独转染,主要是看细胞好不好转了呵呵转染效率高低荧光显微镜下一目了然了。有的细胞荧光强,有的细胞荧光弱,有的没有。所以HBX表达强很可能是少数细胞荧光强的结果,不代表转染效率。YYY. 半干法转移与胶的面积和蛋白分子两大小好像都有关系,那么湿法转移是不是所有的转移条件都一样呢?一般的条件是怎样的?解答:半干转的电流大小是按照面积来算的,时间是根据蛋白分子大小定的;而湿转的话电流是恒定的,时间也是根据分子量而定ZZZ. 转膜时何为湿法,何为半干法?解答:半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统,将膜,胶,滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的,叫湿法;用滤纸吸buffer来做转移体系的叫半干法。AAAA. 为什么浓缩胶和分离胶的电压不一致?同样的电压可以吗?解 答:浓缩胶的目的使得loading 的样品能够在同一条水平线上进入分离胶 ,如果电压太大前端的蛋白容易在后面的蛋白赶上来前进入分离胶。而在分离是理论上(实际上也是)小电压长时间分离的效果会更好,但是在操作过程中没有必要 等那么长的时间,所以就用大电压快点跑。BBBB. 如果目的蛋白比较小,21和38kd,转膜时(Biorad的湿转仪)时间是否能缩短些?100伏电压,甲醇的量是否也可以相应增加?解答:如果是小蛋白可以用小电压28V-36V,4-6hours,(4度)。甲醇10%-20%就可以了。11. 结果分析CCCC. 条带有时清晰,有时很散,不知为何?解答:可能原因:样品可能存在降解;转膜不及时造成扩散;转移缓冲液甲醇浓度(NC膜可加到20%,PVDF加到15%)。DDDD. 显色目的条带又细又浅,靶蛋白是27KD的bcl-xl和67KD 的c-myc,应该是高表达。每个涌道上50-70μg蛋白,开始用半干转移,后来用湿转14v,16h,用PVDF膜转移。胶转移后染色检测,发现小分 子量的基本转移走了,可是为什么条带老是不粗不浓呢?解答:可能跟你的一抗有关系,还有应该高表达,那实际做的阳性对照是否是高表达;还有跟抗原量相关,你多上点蛋白会好的多;跟显色条件相关。EEEE. 背景很花,当然条带也很淡,如果我在显影液中多洗一会儿,背景就很深,以致无法辨认,但有时条带又很明显,背底很淡。解答:这跟你washing的时间和强度有关,很可能你在这方面没有掌握好。显影时间是有范围的,久了肯定不行。FFFF. 纯化过的目的带包括其上下都出现了色带,而且对照菌也出现了条带,会是什么原因?解答:一抗有问题,效价太低,且未纯化;表达量太低;提蛋白时可能出了问题。GGGG. 做Western Blot的检测的时候,用DAB显色还能看出条带,但是换成ECL的时候什么样结果都没有。我用的NOVA公司的发光底物,胶片是普通的X片,定影液和显影液都是别人留下来的,不知道是什么原因?解答:一般的说,Ecl比DAB更灵敏,但是DAB是HRP最敏感的底物,所以有几种可能:ECL底物失活了,你可以检测一下;敏感度正好不到ECl底物的范围。DAB能显色可不能催化ECL底物;显影液没用了。HHHH. 怎样分析结果,需要什么软件?解答:如果你做定量或办定量,至少要用到一个光密度扫描分析软件,如果不是,直接分析就可以了。IIII. 积层胶、分离胶一般多少左右合适?解答:一般电泳是积层胶60-80v,分离胶100v。JJJJ. 采用生物素标记的二抗-SABC-DAB检测系统做western,非特异性的条带和背景高?总蛋白考染的时候发现接近积层胶的条带比较清楚,条带也很 窄,可是越靠下面的条带越来越宽,有的跑得都连在一起了,这是什么原因,如何解决?sds-page的时候恒压和恒流哪个好?解答:非特异性的条带和背景高:可能性太多了,一抗,二抗,封闭的原因都可能。总蛋白考染的时候发现接近积层胶的条带比较清楚,条带也很窄,可是越靠下面的条带越来越宽,有的跑得都连在一起了,这是什么原因,如何解决?正常的,另外,是否是你的积层胶有问题。sds-page的时候,恒压和恒流都可以用。KKKK. 血清样品进行Western Blot 分析,目的蛋白21kD,结果显色出来后,目的条带很淡,而白蛋白和IgG条带很浓?解 答:可能是因为白蛋白为67kD和目的蛋白相差教大,且他的浓度较低,你可以以底物二氨基联苯胺和0.01%过氧化氢溶液显色的时间延长为30分钟,再用 去离子水漂洗以终止反应;也可能是抗体的特异性不好。把封闭的时间延长,同时提高封闭液的浓度,可以减少以下背景噪音。同时洗的时候要彻底,而目的条带 弱,说明浓度不足,如果不考虑后续功能的话,你可以过G-50(细)柱子,纯化你的靶蛋白,接着真空冷冻浓缩,可以得到很漂亮的结果。LLLL. Western转膜已经成功了,但是Marker泳道未见蛋白条带(正常应该有6条),其余各泳道均有清晰的蛋白条带,经考马斯亮蓝染胶,结果相同。经 5%的脱脂牛奶封闭1小时45分钟后,进行一抗孵育(1:200,建议起始浓度)过夜,二抗孵育5个半小时(1:2000),均在室温下,DAB显色,虽 出现蛋白条带,但较弱,且出现非特异性条带。请问:1、Marker是MBI公司的,可分离14-116KD的蛋白,买了大概有一年的时间,是否有问 题?2、一抗(为多克隆抗体)、二抗的浓度及孵育的时间是否合适?3、封闭的时间是否太短?解答:1. marker 有可能被降解了, 也有可能是它标称的上样量太少,不够,我做过一个标称每次5ul可我上了20ul才行的。2.建议,一抗4度过夜也很好, 建议1:100,室温2hrs就够了,3. 二抗室温1小时,1:2000,我喜欢4度封闭过夜(室温2hr就够了),1抗室温1hr,2抗室温1hr,最好是一抗4度过夜(或室温2小时)1:200,2抗室温1小时1:2000, 换ECL法。如有疑问可以电话咨询:0755-66609091.预览相关问答问Western Blot3 回答 226 围观2022-09-19问western blot 实验步骤的细节问题5 回答 424 围观2022-03-11问western blot1 回答 1220 围观2015-01-15相关方法 Western Blot 详解(原理、试剂、步骤及问题解答)2023-07-21 图解 Western Blot 步骤2023-03-03 western blot 操作步骤2023-05-26推荐阅读Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)Western Blot详解-原理Western Blot详解提问48 小时有问必答扫一扫实验小助手关注公众号反馈TOP打开蛋白质印迹(Western blot)实验方案| Abcam中文官网
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转膜与染色
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用于 western blot 的一抗
用于 western blot 的内参对照
β-肌动蛋白抗体 (ab8227) 内参对照
重组抗体 —— 优点
用于 western blot 的二抗
Anti-Rabbit IgG (HRP) (ab205718)
Anti-Mouse IgG (HRP) (ab205719)
IRDye® 二抗
用于 western blot 的一抗
查找合适的 HRP 二抗
荧光 WB 指南
Western blot 培训
我们的 western blot 实验方案包含溶液、试剂、检测步骤和有用的链接,可指导您完成整个实验。2020 年 12 月 14 日审核Western blot 是一项通过凝胶电泳按照分子量大小分离蛋白,然后再利用特异性抗体识别这些蛋白的技术。免疫检测通常使用由硝酸纤维素或 PVDF(聚偏二氟乙烯)制成的膜。将凝胶紧贴膜放置,蛋白在电流作用下从凝胶迁移到膜上。然后利用目标靶点特异性抗体对膜做进一步处理,再通过二抗和检测试剂让膜显色。目录溶液与试剂:裂解缓冲液溶液与试剂:电泳、转膜及封闭缓冲液样本裂解样本制备上样和跑胶蛋白转膜抗体染色相关链接网络研讨会记录查看下方的 western blot 实验方案视频。
查看更多实验方案视频,请单击访问我们的方案视频库。>> 打印完整的 western blot 实验方案>> 查看我们的 western blot 实验方案图如需提升 western blot 分析技能,请查看我们的免费 western blot 培训(可点播)。
溶液与试剂:裂解缓冲液这些缓冲液在 4 ℃ 下可保存数周,也可分装后在 -20 ℃ 下保存长达 1 年。NP-40 缓冲液150 mM 氯化钠1.0% NP-40(可用 0.1% Triton X-100 代替)50 mM Tris-HCl,pH 8.0蛋白酶抑制剂RIPA 缓冲液(放射免疫沉淀检测缓冲液)150 mM 氯化钠1% IGEPAL CA-6300.5% 脱氧胆酸钠0.1% SDS(十二烷基硫酸钠)50 mM Tris-HCl,pH 8.0蛋白酶抑制剂Tris-HCl20 mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)蛋白酶抑制剂
溶液与试剂:电泳、转膜及封闭缓冲液
Laemmli 2X缓冲液/上样缓冲液4% SDS10% 2-巯基乙醇20% 甘油0.004% 溴酚蓝0.125 M Tris-HCl测定 pH 值并将 pH 值调整至 6.8电泳缓冲液(Tris-Glycine/SDS)25mM Tris base(三羟甲基氨基甲烷游离碱)190mM 甘氨酸0.1% SDS测定 pH 值并将 pH 值调整至 8.3转膜缓冲液(湿转)25mM Tris base (三羟甲基氨基甲烷游离碱)190mM 甘氨酸20% 甲醇测定 pH 值并将 pH 值调整至 8.3对于大于 80 kDa 的蛋白,建议 SDS 终浓度为 0.1%。转膜缓冲液(半干转)48mM Tris base39mM 甘氨酸20% 甲醇0.04% SDS封闭缓冲液3–5% 牛奶或 BSA(牛血清白蛋白)加入 TBST 缓冲液。充分混合后过滤。不过滤可能会有斑点沉积,这种小暗点会在显色时影响实验结果。
样本裂解细胞培养裂解液的制备将细胞培养皿放置冰上并用冰冷的 PBS 洗涤细胞。吸出 PBS,然后加入冰冷的裂解缓冲液(每 107 个细胞/100 mm 培养皿/150 cm2 烧瓶加 1 mL;每 5x106 个细胞/60 mm 培养皿/75 cm2 烧瓶加 0.5 mL)。用预冷的塑料细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下,然后轻轻将细胞悬液转移到预冷的小离心管中。或者,用胰蛋白酶消化细胞并用 PBS 洗涤细胞,然后将细胞重悬浮于小离心管内的裂解缓冲液中。4℃ 下持续振摇 30 分钟。放入微型离心机,在 4°C 下离心。您可能需要根据细胞类型改变离心力和离心时间;指南给出的参考标准是在 12,000 rpm 转速下离心 20 分钟,但须根据您的实验确定(白细胞所需的离心力很小)。轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新管中,弃去沉淀。组织裂解液的制备3.1 用干净器械解剖目标组织,最好在冰上,并且越快越好以防蛋白酶降解。将组织放入圆底离心管或 Eppendorf 管中,浸入液氮中“速冻”。样本在 -80°C 储存备用,或放在冰上立即匀浆。对于一块约 5 mg 的组织,向管中迅速加入约 300 μL 裂解液,并用电动匀浆器匀浆,2X 裂解液冲洗刀片两次,每次 200 μL,然后在 4℃ 下(例如将回旋振荡器放入冰箱)持续振摇 2 小时。裂解液的体积必须根据组织总量决定;蛋白提取物不宜过稀释,以免造成蛋白损失,并尽量减少样本体积,以便凝胶上样。最小浓度为 0.1 mg/mL,最佳浓度为 1-5 mg/mL。在微型离心机中 4℃ 下按照 12,000 rpm 的转速离心 20 分钟。轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新管中,弃去沉淀。样本制备取少量裂解液,用于蛋白质定量分析。测定每种细胞裂解液的蛋白质浓度。确定蛋白质的上样量,并添加等体积的 2X 稀释 Laemmli 样本缓冲液。我们建议使用以下方法对样本进行还原和变性,除非在线抗体数据表显示应使用非还原和非变性条件。对样本进行还原和变性时,将样本缓冲液中的细胞裂解液在 100°C 下煮沸 5 分钟。裂解液可等量分装并在 -20°C 下储存备用。上样和跑胶3.1 将等量的蛋白和分子量标志物上样至 SDS-PAGE 凝胶孔中。细胞裂解液或组织匀浆的总蛋白上样量为 20-30 μg,纯化蛋白的上样量为 10-100 ng。3.2 在 100 V 下跑胶 1-2 小时。时间和电压可能需要优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。建议使用还原型凝胶,除非抗体数据表推荐使用非还原性条件。凝胶百分比取决于目标蛋白的大小:蛋白大小凝胶百分比4–40 kDa20%12–45 kDa15%10-70 kDa12.5%15-100 kDa10%25-100 kDa8%也可以使用梯度凝胶。蛋白从凝胶转移到膜膜可以是硝酸纤维素,也可以是 PVDF。用甲醇活化 PVDF 1 分钟,并在制备转膜层之前用转膜缓冲液冲洗 PVDF。转膜时间和电压可能需要优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。可在封闭步骤之前用丽春红染色法检查蛋白质转膜。转膜层的制备如下:
图 1.制备好的转膜层示例。
抗体染色
用封闭缓冲液在室温下封闭膜 1 小时或在 4°C 下封闭过夜。用适当稀释的一抗在封闭缓冲液中孵育膜。我们建议在 4°C 下过夜孵育;其他条件可以优化。用 TBST 洗涤膜 3 次,每次 5 分钟。用推荐稀释度的偶联二抗在封闭缓冲液中室温孵育膜 1 小时。用 TBST 洗涤膜 3 次,每次 5 分钟。产生信号时,请遵循试剂盒生产商的建议。除去多余的试剂,并用透明塑料膜覆盖膜。利用暗室显影技术采集化学发光图像,或利用常规图像扫描法采集比色检测图像。
相关链接
查看更多 western blot 实验方案查看所有 Abcam 内参对照。示例内参对照:ab8227 beta actin
所有泳道:beta Actin 抗体 - 内参对照 (ab8227),稀释度为 1/5000泳道 1:HeLa 全细胞提取物泳道 2:酵母细胞提取物泳道 3:小鼠脑组织裂解液查看我们可提供的阳性对照裂解液、封闭肽和阳性对照蛋白清单。查看蛋白质印迹中表现出色的 AbExcel 二抗。观看我们简单易懂的实验方案视频。实验方案由 Abcam 根据 Abcam 实验室使用 Abcam 试剂和产品开展的实验“按原样”提供;在其他条件下使用实验方案得出的结果可能会有所不同。网络研讨会记录Western blot 的目的在于按照分子量大小在凝胶上分离蛋白。然后将蛋白转移到膜上,从而使用抗体对蛋白进行检测。在含有还原剂(如 β-巯基乙醇)的样本缓冲液中,95 ℃ 下加热样本 5 到 10 分钟。这样可以让线性化蛋白带上与其大小成正比的负电荷。将凝胶放入电泳槽中并加入缓冲液,确保孔的顶部被缓冲液覆盖。所用凝胶的丙烯酰胺百分比取决于靶蛋白的分子量。将分子量标志物上样至第一泳道,然后将样本上样至相邻的孔中。所有样本均含有等量蛋白。所有样本完成上样后,添加电泳缓冲液,给电泳槽盖上盖子。打开电源,按照制造商的推荐设置凝胶槽中凝胶的电压。这时应该能够看到凝胶槽中有上升的气泡。跑胶,直到染料前沿充分移动至凝胶。下一阶段是将蛋白从凝胶转移到膜。膜通常由硝化纤维或 PVDF 制成。从凝胶槽中取出凝胶,并小心地将它从塑料盒中释放。切断孔和凝胶脚,并将凝胶放入转膜缓冲液中。将膜和凝胶夹在滤纸和海绵之间,制备转膜层。膜应靠近正极,凝胶应靠近负极。使用小滚筒去除凝胶和膜之间的气泡。夹住关闭的转膜箱,并将它浸入含有转膜缓冲液的转膜槽中。向外室加水,以保持系统冷却,并盖上盖子。打开电源,开始转移蛋白。时间和电压需要优化,请查看制造商的说明。现在蛋白已经从凝胶转移到硝酸纤维素膜上了,可以用抗体检测目标蛋白了。膜可以从盒中取出,现在应该可以看到分子量标志物了。如有需要,可以用丽春红 S 溶液对膜进行染色,从而确认蛋白质的转移。为了防止抗体发生非特异性结合,需要封闭膜。将封闭缓冲液倒在膜上,并置于摇床上轻轻摇动。通常情况下,需要使用 5% 牛奶或牛血清白蛋白(BSA)溶液在室温下孵育两小时或 4℃ 下孵育过夜。应优化封闭缓冲液的时间和类型,请查看您打算使用的一抗的数据表,了解详细信息。膜封闭后,去除封闭缓冲液,在同一溶液中加入稀释的一抗。与之前一样,置于摇床上孵育。通常会在室温下孵育一抗 1 小时或 4℃ 下孵育过夜。抗体浓度和孵育时间需要优化。如需任何指导,请查阅抗体数据表。倒出一抗,用洗涤缓冲液冲洗膜两次。随后在摇床洗涤膜 1 次,时长 15 分钟,再洗涤膜 3 次,每次 10 分钟。洗涤缓冲液通常是含 0.1% 吐温 20 的 Tris 缓冲盐溶液(TBS)或磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)。倒掉洗涤缓冲液,在偶联二抗中孵育膜,二抗需先在封闭缓冲液中稀释。通常要在室温下孵育一小时,但抗体浓度和孵育时间需要优化。倒掉二抗,并按照上述步骤清洗膜。有几种不同的检测系统。如果二抗与酶偶联,则成像前,应在合适的底物中孵育膜。如果二抗是荧光偶联二抗,可以直接进入成像步骤。成像时使用 X 射线胶片或数字成像系统。将膜放入成像托盘中。将成像托盘放入成像系统。为了清楚地检测与目标蛋白相关的条带,可能需要优化曝光时间。
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Information on antibodies, their selection, and use.
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Detection Overview
Blocking
Primary Antibodies
Secondary Antibodies
Detection Methods
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Tips & Protocols
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Detection Overview
After transfer, proteins from the gel will be immobilized on the membrane. This section describes the process of specifically detecting your particular protein of interest in order to identify and quantify its presence and abundance in the sample. Western blot detection of proteins utilizes primary antibodies that are specific for the target protein which are then in turn recognized by secondary antibodies that are conjugated with enzymes or fluorescent molecules for detection. The correct selection and use of appropriate primary and secondary antibodies is crucial for maximizing signal while reducing background. The proper use of protein loading controls are also critical for signal normalization in quantitative western blotting. We discuss the most popular methods to detect total protein on the membrane for loading controls and their relative advantages and disadvantages.
The Immunodetection Workflow
Western Blotting Antibody Detection
After proteins are transferred from the gel to the membrane, antibodies specific to your protein of interest (primary antibodies) are incubated with the membrane to allow them to recognize their targets. A second incubation with conjugated antibodies specific to the primary antibodies (secondary antibodies) enables visualization by various methods.
Block unbound membrane sites
Membranes are incubated in a blocking agent that masks any sites on the membrane that would allow antibodies to bind non-specifically. Failure to do so raises background.
Incubate with primary antibody. Wash away excess.
Membranes are then incubated with primary antibodies that are specific to your protein of interest. These bind to their targets and any excess is washed away.
Incubate with secondary antibody. Wash away excess.
The membrane is then incubated with secondary antibodies that recognize the primary antibodies and are also conjugated to either an enzyme or a fluoroscent molecule. Any excess is washed away.
Develop signal
For secondary antibodies conjugated with an enzyme, the membrane is incubated with a chemical substrate that produces a signal that can then be detected. If the secondary is conjugated to a fluorescent label, the membrane can be directly imaged in an instrument capable of fluorescent imaging.
Blocking
Following transfer, unoccupied antibody binding sites on the membranes must be blocked to prevent nonspecific binding. Failure to completely block these sites can lead to high backgrounds that obscure the signal.
Various blocking reagents are available, and no single blocker will be optimal for all antibody/antigen combinations. The best blocker for each experiment will depend on the antibody and membrane type. Optimize the detection system for maximal signal with lowest background by testing several blocking agents. Modern formulations like Bio-Rad’s EveryBlot Blocking Buffer are universal, performing well across a wide range of targets, sample types, and detection methods.
Blocking duration also affects the signal and background levels. Blocking for 1 hour with constant agitation is a good starting point. Excessive blocking times may result in lower sensitivity as epitopes can be masked by the blocking agent and proteins washed off the membrane. In contrast, insufficient incubation times will increase nonspecific binding of the primary antibody. Advanced formulations like Bio-Rad’s EveryBlot Blocking Buffer can complete the blocking step in 5 minutes.
For detection of a phosphorylated form of a protein, blocking buffers should not contain phosphorylated proteins to avoid high background signal. Avoid use of nonfat dry milk and instead use BSA, casein, or advanced formulations that are compatible with phosphoprotein detection.
Quick Tips:
Optimizing the Blocking Step in Western Blotting
Watch the video to understand the experimental parameters and which type of blocking agent to use to ensure success of your western blot.
Agent
Pros
Cons
Non-fat milk (1–5%)
Inexpensive, widely available
Not ideal for phosphoproteins, biotin-avidin/streptavidin, or AP detection
Speckling if not completely solubilized
BSA (0.5–5%)
Recommended for phosphoprotein detection, AP/biotin-avidin detection
Not usable with antibodies created using BSA-coupled peptides, phosphotyrosine Ab
Casein (1–2%)
Balance of stringency & sensitivity
Ideal for most detection methods
Blocking may be insufficient for complex biological samples
Gelatin (1–5%)
Inexpensive, widely available
Fish gelatin does not cross-react with mammalian proteins
Porcine gelatin solidifies in cold blocking
Speckling if not completely solubilized
Cannot be used with avidin-biotin detection
Specialized
Advantage depends on product
Can be expensive
Primary Antibodies
An antibody is an immunoglobulin protein such as lgG that is generated in response to exposure to a foreign substance, or antigen. Antibodies have specific affinity for the antigens that elicited their synthesis.
Primary Antibodies
Primary antibodies are raised against a protein of interest and will selectively recognize and bind to target proteins that have been immobilized to a membrane. Antibodies can be designed to be specific for certain parts of a target protein, or they can be designed to be specific for only modified versions of the protein.
Primary Antibody Selection
Antibodies should be specific, selective, and give reproducible results. To ensure the specificity of the primary antibody, it is important to use positive and negative controls when running your blot. As a positive control, purified proteins or lysates overexpressing the target protein can be used. As a negative control, you can include secondary-antibody-only controls (omitting the primary antibody incubation step) and samples from a tissue or cell lysates known not to express the target protein such as cells engineered with a genetic knockout. Before performing the experiments review the literature in order to understand the expression profile of the protein
Selecting Primary Antibodies for Best Results in Western Blotting
Choosing a Primary Antibody for Multiplex Western Blotting
How to Select the Right Antibody
Bio-Rad has developed tips to consider when choosing your antibody.
See Antibody Tips
The wording good and bad antibody or the most specific antibody should be avoided, since a specific antibody in one sample context can give rise to high cross-reactivity in another sample context depending on the nature of the epitope(s) that it will recognize.
— Edfors et. al. 2018, Nature 9:4130
When selecting a phospho-specific antibody for your experiments, it is crucial to ensure that the antibody specifically detects the protein of interest only when it is phosphorylated at the indicated site. You might also want to consider treating cells with growth factors or chemical compounds that induce or inhibit expression of the target.
Monoclonal vs. Polyclonal Antibodies
The antibodies used to detect the target protein in a western blot will be either monoclonal or polyclonal. Polyclonal antibodies consist of a mixed pool of immunoglobulin molecules that bind to several different epitopes found on a single antigen. Polyclonals are usually produced in rabbits, donkeys, sheep, and goats, and are purified from serum.
In contrast, monoclonal antibodies bind to a single epitope within a target antigen. They are composed of homogeneous cloned immunoglobulin molecules, rather than the heterogeneous antibody mixture typical of polyclonals. Monoclonals are made by fusing antibody-producing cells from the spleen of the immunized animal (usually a rat or mouse) with an immortalized cell line to produce single specificity antibodies that can be purified from tissue culture supernatant.
Monoclonal
Polyclonal
Specificity
Specificity for a single epitope.
Varying specificities to multiple epitopes
Identification
Identifies whether a particular region of a protein is present
Identifies the entire target protein via binding at multiple sites. Since multiple epitopes are targeted, there is a higher likelihood of detection of the target
Cross-Reactivity
May cross-react with other proteins that share this epitope, such as isomers or common motifs
Higher background and cross-reactivity possible due to detection of multiple epitopes, any of which may be shared by related proteins
Sensitivity
Usually less sensitive since only a single antibody molecule binds to each target
More sensitive because signal is amplified through the binding of several antibodies per target
Cost
More expensive to produce initially, but available in an unlimited supply
Less expensive to produce initially, but supply is limited to immunized animal(s). Greater variability between preparations
Primary Antibody Incubation
After blocking, the membrane is incubated in a solution containing the primary antibody, usually diluted in blocking buffer. The time and temperature of incubation depends on the binding affinity of the antibody to the target protein and should be determined for each antibody individually. One hour at room temperature with gentle agitation is a good starting point. In order to reduce the background staining, the amount of Tween 20 used in the buffers is also important.
Antibody Concentration
The optimum antibody concentration is the dilution of antibody that still yields a strong positive signal without background or nonspecific reactions. Instructions for antibodies obtained from a manufacturer typically suggest a starting dilution range. For custom antibodies or for those where a dilution range is not suggested, good starting points are:
1:100–1:1,000 dilution when serum or tissue culture supernatants are the source of the primary antibody
1:500–1:10,000 dilution of chromatographically purified monospecific antibodies
1:1,000–1:100,000 dilution may be used when ascites fluid is the source of antibody
Quick Tips:
How to Optimize Primary Antibody Concentration and Incubation for Western Blots
Watch this video to explore considerations for optimizing incubation time and dilution of primary antibodies when performing a western blot.
See Our Western Blotting Primary Antibodies
Phospho-Specific Antibodies
Protein phosphorylation, the addition of a phosphate group to serine, threonine or tyrosine residues, is an important cellular process utilized to send cellular signals from the membrane to the nucleus. Protein phosphorylation may result in conformational changes that trigger the activation or inactivation of an enzyme.
Phospho-specific antibodies are primary antibodies that detect only the phosphorylated forms of proteins and recognize the phosphorylated serine, threonine, or tyrosine residues in the context of the rest of the protein. Using a combination of total protein detection (using primary antibodies that recognize both phosphorylated and non-phosphorylated forms of the protein) and phospho-specific antibodies, it is possible to assess the degree of phosphorylation for any given protein.
Prior to using phospho-specific antibodies, ensure that the antibodies have been validated for your experimental system. This can be accomplished by using positive and negative controls. For example, lysates from cells that are either untreated or have been treated to stimulate the pathway of interest can act as negative and positive controls. Likewise, absence of detection can act as a negative control on lysates that have been treated with lambda phosphatase to remove phosphate groups.
See Our Phospho-Specific Antibodies
Secondary Antibodies
Purification of Cross-Adsorbed Antibodies
A solution of secondary antibodies raised against mouse lgG is passed over a column containing immobilized serum proteins from potentially cross-reactive species such as rat or rabbit.
Only antibodies highly specific for mouse lgG will flow through the column, while antibodies cross-reacting to rat or rabbit will bind and remain in the column. The flow-through solution contains antibodies that specifically recognize mouse lgG.
Secondary antibodies are specific for the isotype and species of the primary antibody. For example, a goat anti-rabbit secondary is an antibody raised in goats against a primary antibody raised in rabbits.
Secondary antibodies bind to a number of different conserved regions on the primary antibody, and act to amplify the signal, increasing detection sensitivity. Secondary antibodies are labelled with either an enzyme for colorimetric or chemiluminescent detection or with a fluorescent dye for fluorescent detection of the protein of interest.
Cross-Adsorbed Antibodies
Secondary antibodies raised against primary antibodies of one species can recognize those from other species, especially if they are from closely related animals. For example, parts of the constant regions of mouse and rat antibodies are evolutionarily conserved, leading to conserved epitopes between both species. Since secondary antibodies are generally polyclonal, when generating secondaries against mouse, a subset of those secondaries will be specific for those conserved epitopes, being able to recognize them whether the epitope resides on a mouse or rat antibody. This cross-reactivity could lead to unexpected bands when multiplexing or cause high background.
To remove the undesired antibodies from a polyclonal pool, an affinity chromatography column is used to purify the secondary antibody preparation of offending cross-reactive species. Clonal antibodies that recognize the immobilized antigen(s) are removed. The unbound pool of antibodies is now cross-adsorbed against the immobilized antigen and should show no reactivity towards it.
The most common type of cross-adsorbed secondary antibody is species specific, which is most useful for multiplexing, although there are also instances when isotype-specific antibodies are required. For example, immunization with a purified IgG1 preparation might be expected to generate a serum with a specific reactivity towards IgG1 and no cross-reactivity with other antibody isotypes. However, due to the polyclonal nature of the serum combined with the conservation of some epitopes between classes and isotypes, a component of the polyclonal serum may react with an epitope on IgG1 that is also found on IgG2a, confounding the isotype specificity.
A solution of secondary antibodies raised against mouse IgG is passed over a column containing immobilized serum proteins from potentially cross-reactive species such as rat or rabbit.
Only antibodies highly specific for mouse IgG will flow through the column, while antibodies cross-reacting to rat or rabbit will bind and remain in the column. The flow-through solution contains antibodies that specifically recognize mouse IgG.
Secondary Antibody Concentration
Similar to primary antibodies, the optimum antibody concentration is the dilution of antibody that still yields a strong positive signal without background or nonspecific reactions. Fortunately, high-quality secondary antibodies are commonly available, and manufacturers typically suggest a starting dilution range.
See Our Western Blotting Secondary Antibodies
Quick Tips: How to Choose Secondary Antibodies for Multiplex Western Blotting
In this video, we discuss the best practices for selecting secondary antibodies that are compatible with your primary antibodies and your detection methods to produce high-quality, reproducible results.
Detection Methods
In the past, many different methods were used for western blot detection, but now the vast majority employ enzymatic chemiluminescence or fluorescent detection. Thus, most secondary antibodies are conjugated to an enzyme such as alkaline phosphatase (AP) or horseradish peroxidase (HRP) for use with a chemiluminescent substrate or labeled with a fluorescent compound for imaging.
Chemiluminescence Detection
Chemiluminescence is a chemical reaction in which the oxidation of a chemical substrate such as luminol is catalyzed by an enzyme, typically horseradish peroxidase (HRP), and the reaction produces light as a byproduct. The resulting light can be captured on film or by a digital imager.
Luminol emits light only weakly, so enhancers are added to the reaction to increase the signal. This enhancement of a luminol-based signal is commonly referred to as enhanced chemiluminescence (ECL). There are a number of different enhancers available, some of which can increase the signal by as much as a 1,000-fold, making ECL more sensitive than other common detection systems such as conversion of substrates to colored precipitates.
The light intensity will be roughly proportional to the quantity of your protein of interest, allowing semi-quantitation of relative protein abundance. Since this detection method relies on an enzyme-substrate interaction, the kinetics of the reaction plays a role in the linearity of the signal. Therefore, for more accurate quantitation, care must be taken to ensure that the sample load is within the linear range of the assay and the detection signal is not saturated.
Luminol oxidized by HRP in the presence of H2O2 leads to the formation of a 3-aminophthalate dianion and the release of light.
Quick Tips:
How to Image a Chemiluminescent Western Blot
Watch this video to see how to prepare a western blot membrane for chemiluminescent detection and ensure a strong chemifluorescent signal during image acquisition.
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Fluorescence Detection
In fluorescence detection, a primary or secondary antibody is labeled with a fluorescent molecule (a dye or fluorophore). A light source that produces photons within the fluorophore's excitation spectrum excites the fluorophore, and the fluorophore then emits photons with a longer wavelength. The difference in wavelength between excitation and emitted light is termed Stokes shift. This emitted light of longer wavelength can then be distinguished from the excitation light via appropriately designed optical filters and detected by a digital imager.
Fluorescence detection has a number of advantages over traditional chemiluminescent detection. As fluorescent detection does not rely on an enzyme-substrate reaction, the use of fluorophores can be more quantitative than chemiluminescent detection, is often faster, and reduces waste.
The greatest advantage of fluorescent western blotting detection over chemiluminescent detection is the ability to simultaneously detect a large number of proteins on one blot, using a process called multiplexing. This relies on choosing fluorophores that fluoresce at different wavelengths and can be distinguished by the digital imager.
Fluorophore Selection
When using fluorescence detection, consider the following optical characteristics of the fluorophores to optimize the signal:
Quantum yield — efficiency of photon emission after absorption of a photon. Processes that return the fluorophore to the ground state but do not result in the emission of a fluorescence photon lower the quantum yield. Fluorophores with higher quantum yields are generally brighter.
Extinction coefficient — measurement of how well a fluorophore absorbs light at a specific wavelength. Since absorbance depends on path length and concentration (Beer's Law), the extinction coefficient is usually expressed in cm -1 M-1. As with quantum yield, fluorophores with higher extinction coefficients are usually brighter.
Stokes shift — the difference in the maximum excitation and emission wavelengths of a fluorophore. Since some energy is dissipated while the fluorophore is in the excited state, emitted photons are of lower energy (longer wavelength) than the light used for excitation. Larger Stokes shifts minimize overlap between the excitation and emission wavelengths, increasing the detected signal.
Excitation and emission spectra — excitation spectra are plots of the fluorescence intensity of a fluorophore over the range of excitation wavelengths; emission spectra show the emission wavelengths of the fluorescing molecule. Choose fluorophores that can be excited by the light source in the imager and that have emission spectra that can be captured by the instrument. When performing multiplex western blots, choose fluorophores with widely separated emission spectra to enable good signal separation among the different color channels.
Fluorophore Stokes Shift
A high-energy photon excites a fluorophore, causing it to leave the ground state (S0) and enter a higher energy state (S11). Some of this energy dissipates, allowing the fluorophore to enter a relaxed excited state (S1). When the fluorophore returns to the ground state, a photon of light is emitted. Since some of the energy was dissipated, the emitted photon is of lower energy (longer wavelength).
The difference in wavelength between the exciting light and the emitted light is called the Stokes shift. Larger Stokes shifts minimize the overlap between the excitation and emission wavelengths, increasing the detection signal-to-noise ratio.
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Total Protein Detection
Total protein staining provides an image of the complete protein pattern on the blot. This information helps determine transfer efficiency and molecular weight of the transferred proteins. This information can also be used to determine relative quantity of sample that was loaded in each lane.
Several total protein stains are available and commonly used in western blotting. The table below provides an overview of total protein detection methods and applications.
Total Protein Detection Methods for Western Blotting
Detection Method
Sensitivity
Advantages
Disadvantages
Imaging
Anionic dyes (Ponceau S, Fast Green, Coomassie Brilliant Blue, Amido black)
100–1,000 ng
Inexpensive, rapid
Coomassie and Amido black are not compatible with downstream immunodetection
Epi illumination
Fluorescent stains (SYPRO Ruby and Deep Purple)
2–8 ng
Sensitive; most are compatible with immunodetection
Additional staining and destaining steps
Fluorescent capable digital imager with UV, visible light LED, or lasers
Stain-Free Imaging
2–28 ng
Rapid and convenient—ready in less than one minute, and no separate staining or destaining required. Sensitivity comparable to Coomassie
Requires use of Stain-Free Gels and compatible imager
Bio-Rad imagers
Stain-Free Imaging Technology
Bio-Rad's stain-free technology allows direct visualization, analysis, and documentation of protein samples in PAGE gels and on blots, without staining or destaining. Stain-free imaging provides equal or better sensitivity compared to Coomassie staining and eliminates organic waste disposal concerns.
Linear dynamic range provided by stain-free technology for total protein measurements. HeLa cell lysate dilutions from 80–2.5 µg total protein.
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Total Protein Normalization
Bio-Rad’s stain-free technology can be used for total protein normalization of western blots. Total protein normalization uses the signal of all proteins in a sample to determine load. This approach is more robust against expression changes of any one protein to an experimental condition, which can occur when using a single “housekeeping” protein.
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Immunodetection Tips and Protocols
Western Detection Tips
Use high-quality primary antibodies.
A good antibody is sensitive, meaning it can detect low amounts of your target, and is also specific, recognizing only the target, without giving spurious secondary bands. Antibody vendors are increasingly offering antibodies that have been certified for western blotting.
Use cross-adsorbed secondary antibodies.
Cross-adsorbed antibodies offer a lower chance of cross-reactivity and reduced background giving more reliable results. They are readily commercially available so they should be used whenever possible.
Optimize antibody concentration to maximize signal to background.
Sensitive detection of your target depends on high signal and low background. Reducing antibody concentration can reduce desired signal, but the greater reduction of background more than makes up for this.
For multiplex detection, first optimize antibodies to targets individually.
When detecting multiple targets simultaneously, carry out detection of each target individually first. This will simplify any needed troubleshooting.
Western Detection Protocols and Resources
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Western Blotting Protocol Library
Filter by your laboratory set-up and reagents to get a custom western blotting protocol that best fits your needs.
Stain-Free Western Blotting Guide
Find out how Stain-Free technology can revolutionize your western blotting.
Better Western Blotting Guide
Tips, Techniques, and Technologies from the Western Blotting Experts at Bio-Rad Laboratories.
Protein Blotting Guide
(PDF 7.2 MB)
Details on blotting technology, methods, products, tips, techniques, and troubleshooting guidelines.
Western Blot Doctor
Our self-help troubleshooting guide covers solutions to many common and not-so-common western blotting issues and helps your blots look their best.
Best Practice for Western Blot Detection of Phosphorylation Events
Ten tips to ensure robust data generation and cleaner blots.
Protocol: Detection of Phosphorylated Proteins by Western Blotting
This protocol describes how to detect phosphorylated proteins by western blotting using Phospho-Specific PrecisionAb Antibodies.
Fundamentals of Western Blotting Course #3: Immunodetection
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This simple tool allows users to keep track of their Western Blotting experiment from sample preparation to imaging.
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